豬流行性腹瀉的診斷與防治

豬流行性腹瀉的診斷與防治

豬腹瀉（ped）是由豬流行腹瀉病毒（pedv）引起的豬急性腸道感染的豬。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒屬(coronavirus)的成員。主要引起豬流行性腹瀉。各種年齡、各個品種豬均可感染發(fā)病,哺乳仔豬、架子豬、育肥豬的發(fā)病率可達100%,成年母豬發(fā)病率為15%~90%。其發(fā)病特點是:日齡小,癥狀重,日齡大,癥狀輕。1周齡哺乳仔豬常在腹瀉3~4u2005d后脫水死亡,病死率達50%。斷奶豬、育肥豬癥狀較輕,腹瀉可持續(xù)4~7u2005d,成年豬僅發(fā)生嘔吐和厭食。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)同屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬,2種病毒感染后所引起發(fā)病豬的臨床癥狀、流行特點和病理變化都極其相似,均給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重危害。當前PED發(fā)生率居高不下,發(fā)病情況也越來越復(fù)雜,出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象時有發(fā)生,目前倍受廣大研究者的重視。本文主要針對PEDV的基因組結(jié)構(gòu)、功能和PED疫苗的研究進展進行了綜述,為豬流行性腹瀉基因的深入研究及對PED的預(yù)防提供參考。1u2005u2005pedv基因結(jié)構(gòu)與功能1.1人工誘導(dǎo)的多聚酶基因Pol基因編碼依賴于RNA的非結(jié)構(gòu)蛋白,即復(fù)制酶多聚蛋白1ab(pp1ab),為RNA多聚酶。復(fù)制酶多聚蛋白分子質(zhì)量約為753u2005ku,有13個預(yù)測蛋白酶切割位點。PEDV基因組中S基因上游除編碼多聚酶的基因外并無其它基因。這同缺乏PEDV相關(guān)的血細胞凝集酶活性結(jié)果一致。因為,如果冠狀病毒基因組存在這樣一種基因,它必定總是存在于S和多聚酶基因之間。多聚酶基因由2個大的重疊的開放性閱讀框架ORF1a(12u2005354u2005nt)和ORF1b(8u2005037u2005nt)組成,其中ORF1a和ORF1b共有46個核苷酸的重疊,重疊區(qū)有一特異性7核苷酸序列(UUUAAAC)和一假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。多聚酶基因翻譯成2個多蛋白前體,即pp1a和pp1ab,較大的蛋白pp1ab則是通過核糖體移碼機制合成,并需要特異性7核苷酸序列和假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。ORFla主要編碼蛋白水解酶,包括分別切割復(fù)制酶多聚蛋白N端和C端的類木瓜蛋白酶(PL-PRO)和類脊髓灰質(zhì)炎病毒3C蛋白酶(3CL-PRO)。PL-PRO的切割活性對鋅具有強依賴性。3CL-PRO識別底物的核心序列是(ILMF)-Q-I-(SAGC)。另外,ORF1a編碼蛋白還含有3個轉(zhuǎn)膜域(TM)。ORFlb主要編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp),同時有3個蛋白結(jié)構(gòu)域分別是鋅指蛋白域(Z)也稱金屬結(jié)合域、螺旋酶域(He1)和保守序列域(C)。復(fù)制酶多聚蛋白經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理后產(chǎn)生與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的一系列蛋白質(zhì),主要功能包括負鏈RNA、前導(dǎo)RNA、sgmRNA(亞基因組RNA)和子代病RNA的轉(zhuǎn)錄作用以及對多聚蛋白切割產(chǎn)生具有功能產(chǎn)物的蛋白酶切割作用。因此,在病毒感染早期發(fā)揮重要作用。1.2pedv基因與hcv29e的同源性PEDVu2005S基因的啟動密碼子通常并不是用于啟動蛋白質(zhì)的合成,而是翻譯分子量為180~220u2005ku的1u2005383個氨基酸的多肽,即S蛋白,該多肽含有29個潛在的N-連接的糖基化位點,是PEDV的1個重要的結(jié)構(gòu)蛋白,是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白,并有與其他冠狀病毒纖突蛋白相似的結(jié)構(gòu)特點。序列同一性比較表明,PEDVS基因與HCV229E(人冠狀病毒)的序列分別有60%(S2區(qū))和37.0%(S1區(qū))的同源性;與FIPV(貓傳染性腹膜炎病毒)、TGEV、和CCV(犬冠狀病毒)的S序列分別有59.%~60.0%(S1區(qū))和35.5%~35.9%(S2區(qū))的同源性。PEDV和HCV229E旁側(cè)序列在迄今所測定的所有S蛋白基因中都顯示了保守性。S蛋白在免疫反應(yīng)中起重要作用,在病毒感染宿主機體后介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用,如識別靶細胞、促進病毒和細胞膜融合的作用,故S蛋白被認為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原。此外,S蛋白有27~29個潛在的糖基化位點,在低滲非離子溶劑中溶解度最大。當pH值為4時,S蛋白溶解度最大,而N蛋白則要求pH為9。制備的S蛋白和N蛋白可用作ELISA抗原,分別命名為S-ELISA和N-ELISA。S-ELISA比N-ELISA更為有效。感染PEDV豬血清中的抗S蛋白抗體比抗N蛋白抗體更為持久,即可在更長的時間中檢測到抗S蛋白的抗體。1.3pedv中的核苷酸缺失ORF3基因能編碼ORF3蛋白。ORF3蛋白為223個氨基酸的多肽,分子質(zhì)量為25.3u2005ku,是一種非結(jié)構(gòu)蛋白,其位置在116~784個核苷酸之間。ORF3基因編碼的產(chǎn)物存在一個含6個His的尾。ORF3基因至少存在3個可變區(qū),有短的核苷酸缺失(2~7u2005nt)。對PEDV的2個不同分離株CV777和Br1/87的測序后發(fā)現(xiàn),這些核苷酸缺失2個分離株都有。ORF3序列中還發(fā)現(xiàn)了兩個功能基序(Motif):精氨酸酶信號肽和ATP/GTP結(jié)合位點。由于ORF3基因中核苷酸缺失的存在,所以不能通過細胞培養(yǎng)復(fù)制ORF3基因產(chǎn)物。對PEDVu2005CV777和Br1/87兩個不同分離株的研究發(fā)現(xiàn),雖然有時核苷酸缺失是在相同的位置,但缺失并不總是相同?？梢哉J為,CV777和Br1/87起源于相同的病毒群,但以后各自進化了。Park等(2007)對PEDVu2005DRl3強、弱毒的ORF3序列進行了分析,發(fā)現(xiàn)致弱的DRl3在ORF3有17個氨基酸的缺失,為強、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據(jù)。說明ORF3基因與病毒毒力有關(guān)。1.4pedv的sm基因序列及分析sM基因編碼E蛋白,E蛋白是PEDV最小的結(jié)構(gòu)蛋白,由76個氨基酸組成,預(yù)測分子量為8.8u2005ku,其散在分布于病毒囊膜上,在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關(guān)重要的作用。PEDV的sM基因序列與HCV229E和TGEV的相比,分別有54%和29%的同源性。PEDVu20052個病毒分離株u2005CV777和Brl/87的sM基因嚴格保守。Northern雜交分析PEDV亞基因組RNA時發(fā)現(xiàn),編碼sM多肽的mRNA同預(yù)測的RNA5(成熟的病毒粒子中的第5個RNA組分)電泳遷移率相同。目前,研究者將PEDV的sM基因和Mu2005基因?qū)爰撞《据d體(pS~FV),在BHK-21u2005細胞中得到了成功的表達,為進一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ)。1.5pedv在m基因上的差異M基因編碼M蛋白,M蛋白是一種穿膜蛋白,由226個氨基酸組成,分子量介于27~32u2005ku之間。對M基因的序列比較分析表明,PEDV與HCV229E和TGEV的同源性分別為57%和53%。CV777和Br1/87核苷酸序列比較分析表明,在M基因上僅有2個核苷酸的差異。M基因非常保守,PCR檢測時PEDV的引物一般都是針對M基因而設(shè)計的。M蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用,同時也是病毒刺激機體產(chǎn)生免疫保護的重要結(jié)構(gòu)蛋白。另外,M蛋白能介導(dǎo)機體產(chǎn)生干擾素,所以Mu2005蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選基因。因此獲得M基因在體外有效的蛋白表達產(chǎn)物,無論是對PEDV感染增殖的基礎(chǔ)性研究,還是利用M蛋白進行病原鑒定或疾病免疫預(yù)防,均具有重要的理論和實踐意義?，F(xiàn)已用兔抗肽血清鑒定PEDVu2005M蛋白,并用桿狀病毒進行了表達?；钚缘腗蛋白為N-糖基化,分子量約為27u2005ku,而重組體桿狀病毒合成的M蛋白(相對分子質(zhì)量)Mr為23ku,且與未糖基化的M蛋白有著相同的電泳遷移率。1.6病毒同源性分析PEDVu2005N基因編碼N蛋白。N蛋白是PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,主要作用是形成核衣殼,相對分子量為大小為55~58u2005ku,由441個氨基酸組成。對PEDVu2005CV777u2005和Brl/87u20052個分離株N基因序列分析發(fā)現(xiàn)僅有2個堿基的差異,用套式PCR擴增4個分離株P(guān)EDVu2005N基因540u2005nt的片段后發(fā)現(xiàn),其核苷酸序列基本相同。N基因1u2005323個核苷酸的序列表明,PEDV與其他冠狀病毒Nu2005基因序列有相當部分相同。但PEDVu2005N基因明顯比HCV229E和TGEV大,其中有一段大約135u2005nt的潛在插入存在,其可能位于N基因中央。PEDV與TGEV、HCV229E的N蛋白的明顯不同之處就是在PEDVu2005N蛋白中央部分有一段接近40個氨基酸的特別殘基,其中富含天門冬酰胺,絲氨酸和精氨酸。N基因在氨基酸和核苷酸水平上與HCV229E有很大的同源性,其序列與MHV、IBV、HCV的同源性為12%~19%,與FIPV、CCV、PRCV、TGEV、HCV229E的同源性較高,為32%~37%。N蛋白氨基酸序列比較,PEDV和HCV229E有63個相同的殘基,而和TGEV有49個相同的殘基。PEDV、TGEV、HCV229E的N端序列的一致性比C端高。N基因處于PEDV基因組3′端,N基因的3′端和poly(A)尾之間有一個11個核苷酸的保守序列,這一序列是病毒復(fù)制過程中RNA負鏈合成的識別位點。N基因的5′端也存在一個類似于內(nèi)部保守基因為7u2005nt的序列。N基因還有一個336個核苷酸的ORF,編碼富含Leu的蛋白。適應(yīng)細胞生長的PEDVu2005N基因含有3個內(nèi)部開放閱讀框(internalu2005openu2005readingu2005frames,Iu2005ORF),分別命名為I-1(113個密碼子),I-2(63個密碼子)和I-3(72個密碼子),3個Iu2005ORF均絕對保守。而牛的冠狀病毒(BCV)Iu2005ORFu2005(208個密碼子)表達一個與膜有關(guān)的23u2005Ku的蛋白,但其生物學(xué)作用仍有待測定。MHV(鼠肝炎病毒)的Iu2005ORFu2005(207個密碼子)編碼一結(jié)構(gòu)蛋白,該蛋白與病毒復(fù)制無關(guān)。PEDV所有3個Iu2005ORF的共同編碼作用與BCV或MHV大約相當。野生型PEDVu2005CV777分離株3′端整個N基因和非編譯區(qū)的1u2005800個核苷酸序列分析表明,野生型PEDV同適應(yīng)細胞生長的PEDV相似,N基因下游未發(fā)現(xiàn)其他基因。病毒的細胞培養(yǎng)不會導(dǎo)致該基因組區(qū)任何核苷酸的變化,然而,適應(yīng)細胞生長的PEDV對新生仔豬的致病力是明顯減弱了,這證明了該段基因及其基因產(chǎn)物對PED病毒致弱無關(guān)。不同冠狀病毒N蛋白比較顯示:在PEDVu2005N蛋白中央有相當長的親水區(qū)域。另外N蛋白除和基因組RNA纏繞形成核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)復(fù)合體外,還參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。N蛋白等電點高,缺少糖基化和RNA結(jié)合位點,PEDV完整的N蛋白等電點為10.5,但C端50個殘基的等電點很低,僅為3.4,這是由于其C端殘基通常是帶負電荷或呈中性。病毒感染細胞中N蛋白較豐富,Nu2005蛋白能與病毒多聚酶作用,或許還有可能同細胞因子作用,從而改變宿主細胞的轉(zhuǎn)錄。N蛋白有6~7個潛在的磷酸化位點,在pHu20059.0低滲非離子溶劑中溶解度最大。N蛋白有3個相對保守的結(jié)構(gòu)域,位于中間的是一個能與病毒RNAu2005前導(dǎo)列結(jié)合的RNA結(jié)合域。此外,在對冠狀病毒一些成員N蛋白亞細胞定位的研究中表明N蛋白在細胞核(或核仁)中定位的特征,進而也闡明了N蛋白的一些功能,N蛋白作為一個調(diào)節(jié)蛋白起作用,能夠干擾宿主細胞周期,參與細胞通信,N蛋白還可以抑制干擾素的產(chǎn)生,誘導(dǎo)細胞調(diào)亡。而對PEDVu2005N蛋白亞細胞定位特征的研究還沒有報道。N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大,在感染的細胞中能得到大量表達。豬在感染PEDV的早期,體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體。又鑒于其冠狀病毒N蛋白保守性強,所以利用N蛋白來建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。2ped疫苗的研究對PED的預(yù)防和控制應(yīng)以接種疫苗為主,國內(nèi)外的研究者在PED疫苗的研究方面已經(jīng)做了大量的工作,但到目前為止還沒有研制出特別有效的疫苗可以控制PED疾病的發(fā)生。下面僅就豬流行性腹瀉各類疫苗的研究應(yīng)用現(xiàn)狀及前景進行概述。2.1免疫保護率及毒價滅活疫苗包括組織滅活疫苗和細胞滅活疫苗。由于組織滅活苗效果很好,目前應(yīng)用最為廣泛。哈爾濱獸醫(yī)研究所、上海農(nóng)科院牧醫(yī)所和江蘇農(nóng)科院牧醫(yī)所等單位試生產(chǎn)。王明等用PED滬株研制氫氧化鋁滅活苗接種后海穴,以0.1mL/頭主動免疫3日齡仔豬,保護率為77.28%;以0.5mL/頭主動免疫接種3~22日齡豬,保護率為85%;以5mL/u2005頭被動接種妊娠母豬,其所產(chǎn)3日齡仔豬的保護率為97.06%。接種疫苗后14du2005開始產(chǎn)生免疫力,免疫期可達6個月。細胞滅活苗制備方便,應(yīng)用也越來越廣泛。馬思奇等(1994)研制的氫氧化鋁細胞滅活疫苗的主動免疫試驗和被動免疫試驗的保護率分別為88.89%及90.7%,并研制了豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)氫氧化鋁細胞滅活疫苗,滅活前毒價均為107.0~107.5TCID50/0.3u2005mL,主動免疫保護率:TGE為100%、PED為92%,被動免疫保護率:TGE為87.9%、PED為u200582.4%,免疫期均為6個月。疫苗保存期1年,田間試驗保護率92%~96.35%。2.2在肌肉注射和口服免疫組治療pedv的應(yīng)用結(jié)果見表1由于滅活苗產(chǎn)生完全免疫力需要2周時間,且劑量偏大,不利于緊急預(yù)防與降低疫苗費用,所以又研制了細胞弱毒苗。國外Park等將PEDV經(jīng)u2005Verou2005細胞致弱后的毒株DR13,通過口服和肌肉注射兩種途徑免疫晚期妊娠母豬,觀察所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率。結(jié)果口服免疫組的發(fā)病率(13%)遠低于肌肉注射免疫組(60%),且口服免疫組仔豬抗PEDV的SIgA含量明顯高于肌肉注射免疫組。研究表明,可應(yīng)用PEDV細胞弱毒苗經(jīng)口免疫晚期妊娠母豬,從而有效預(yù)防PEDV感染。Kweon等用分離到的野毒株(命名為KPEDV-9),使之適應(yīng)Vero細胞并連續(xù)傳代至93代,進行主動免疫試驗、被動免疫試驗以及安全性試驗,結(jié)果都證實可作為弱毒苗使用。適應(yīng)Vero細胞并連續(xù)傳代至93u2005代的KPEDV-9,接種妊娠母豬,ELISA檢測結(jié)果表明,母豬免疫應(yīng)答水平大幅度提高,且新生仔豬可抵抗PEDVu2005野毒感染。國內(nèi)佟有恩等用CV777株強毒株適應(yīng)Vero細胞系,并在83代后適應(yīng)了仔豬腎原代細胞。以104~124代細胞適應(yīng)毒制備5批疫苗,主動免疫試驗的總保護率為95.92%;以106~139代細胞適應(yīng)毒制備的8批疫苗,主動免疫試驗的總保護率為96.2%。在與TGEV弱毒組合制備的二聯(lián)弱毒苗的初步田間試驗中取得良好效果。2.3合成乳酸桿菌疫苗乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑中的主要益生菌,廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工業(yè)。構(gòu)建乳酸桿菌質(zhì)粒載體,表達在黏膜系統(tǒng)中增殖的病原微生物的保護性抗原基因,制備綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態(tài)制劑疫苗應(yīng)用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途徑。因此,研制刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)的TGE和PED基因工程乳酸桿菌疫苗有重要意義。目前,有的實驗室正在開展乳酸桿菌表達TGEV、PEDV主要保護性抗原基因的研究。此研究擬從健康豬體內(nèi)分離鑒定出乳酸桿菌,并進一步篩選出thyA基因缺陷型乳酸桿菌,構(gòu)建含有TGEV或PEDV主要保護性抗原基因的以thyA基因為選擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達載體,轉(zhuǎn)化乳酸桿菌,制備基因工程乳酸桿菌疫苗。目前已篩選出2株thyA基因缺陷型乳酸桿菌,并已初步鑒定。TGEV、PEDV的S基因的克隆擴增工作亦已結(jié)束。2.4pedv基因表達蛋白Yang等(2003)將PEDV的S基因轉(zhuǎn)入煙草中,提取轉(zhuǎn)基因植物蛋白給小鼠注射,進行血清蝕斑減數(shù)中和測定,證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫。Yang等(2005)相繼應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)入法將PEDV的S基因的主要抗原位點(命名為K-COE)和合成的PEDV中和抗原表位在煙草中表達,前者重組體蛋白占轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶性植物蛋白含量的0.1%,后者含量則為2.1%。這些研究為研制PEDV口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了新的思路。目前,在以煙草花葉病毒為載體的無煙堿煙草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表達,用表達蛋白免疫接種后,對仔豬具有良好的保護作用,為PEDV轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。一些研究者將PEDV的E基因和M基因?qū)爰撞《据d體中,在BHK-21細胞中得到了成功表達,這為進一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ)。植物的多種優(yōu)越性均可被用于研究轉(zhuǎn)基因疫苗,并且已經(jīng)取得了很大的進展。但仍有一些障礙必須克服,如蛋白在植物中的表達水平低、表達產(chǎn)物在植物中的穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)基因口服疫苗在產(chǎn)生免疫反應(yīng)之前在胃腸道內(nèi)有時被消化等,科學(xué)家就這些問題進行了研究并正在加以解決。2.5制苗疫苗的應(yīng)用核酸疫苗又稱為基因疫苗、DNA疫苗,是20世紀90年代初從基因治療研究領(lǐng)域發(fā)展起來的一種全新疫苗,與傳統(tǒng)的弱毒或滅活疫苗相比,DNA疫苗具有不散毒、不返強的優(yōu)點。DNA疫苗還具有可以制成標記性疫苗,便于臨床診斷監(jiān)測;疫苗性質(zhì)穩(wěn)定,便于儲存和運輸;應(yīng)用范圍廣,不僅可用于傳染病和寄生蟲病的免疫預(yù)防,而且還能夠用于腫瘤、自身免疫、過敏反應(yīng)等疾病的治療等優(yōu)點。另外,與亞單位疫苗相比,具有能長期激發(fā)機體體液和細胞免疫反應(yīng)、制備工藝簡單和費用低廉(不用純化蛋白)的優(yōu)點。雖然核酸疫苗兼具亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗的有效性,但核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產(chǎn)生抗菌素DNA抗體等危險性,其安全性還有待于進一步觀察。豬流行性腹瀉核酸疫苗的研究還處于起步階段,是今后研究的熱點之一。2.6研制聯(lián)苗的可行性TGEV和PEDV均屬冠狀病毒,致病機理相似,組織嗜性相同。因此,研制聯(lián)苗亦是可行的。尤其在我國豬病毒性腹瀉廣泛流行,研制多聯(lián)苗更是十分必要的。2.6.1聯(lián)疫苗的免疫效力該系列產(chǎn)品包括豬傳染性胃腸炎(TGE)和豬流行性腹瀉(PED)二聯(lián)滅活苗、二聯(lián)活疫苗和弱毒二聯(lián)疫苗,二聯(lián)滅活苗和二聯(lián)活疫苗是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的馬思奇、佟有恩共同主持完成的。該二聯(lián)疫苗的特點是:毒價高,后海穴接種(是對常規(guī)免疫途徑的突破),增強了免疫保護力,一次接種即可,省時、省力。經(jīng)國內(nèi)外聯(lián)機檢索查新證明,該二聯(lián)苗是國際領(lǐng)先研制成功的,并在技術(shù)上有原始創(chuàng)新。兩種疫苗可用于主動免疫保護不同年齡的豬只,但主要用于妊娠母豬的被動免疫以保護仔豬。其中二聯(lián)滅活苗主動免疫保護率為96%,被動免疫保護率為85.1%;二聯(lián)活疫苗主動免疫保護率為97.7%,被動免疫保護率為98%。2種二聯(lián)疫苗的免疫期均為6個月,仔豬被動免疫期是哺乳期至斷奶后1周。二聯(lián)滅活疫苗在免疫后14u2005d產(chǎn)生免疫力;二聯(lián)活疫苗免疫后7u2005d產(chǎn)生堅強的保護。PED和TGE弱毒二聯(lián)疫苗是用豬流行性腹瀉弱毒疫苗株P(guān)EDV-G1P83和豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗株TGEV-AG1制成。用該弱毒二聯(lián)疫苗進行了保存期試驗、安全效力、免疫期試驗和區(qū)域試驗。結(jié)果表明,試驗疫苗在-20u2005℃保存4個月,經(jīng)4個月保存的疫苗免疫效力未見下降。4u2005℃保存48u2005h對疫苗病毒的毒價沒有明顯影響。用該弱毒二聯(lián)疫苗按程序免疫妊娠母豬,對妊娠母豬安全,其仔豬獲得了良好的被動免疫。其對PEDV強毒、TGEV強毒和2種強毒混合攻擊的免疫效力分別達90.48%、93.75%和87.5%。用二聯(lián)弱毒疫苗免疫8~10日齡的哺乳仔豬證明安全,28日齡時(25日齡斷奶)分別用PEDV強毒、TGEV強毒和2種混合強毒攻擊,免疫效力分別為100%、99.9%和73.3%。結(jié)果表明,該弱毒二聯(lián)疫苗能夠安全地對妊娠母豬和哺乳仔豬進行免疫,免疫后能有效地保護初生仔豬、斷奶豬和肥育豬抵抗TGEV和PEDV強毒的攻擊。該弱毒二聯(lián)疫苗在區(qū)域試驗中能顯著降低豬病毒性腹瀉的發(fā)病率和死亡率。2.6.2單股正鏈的結(jié)構(gòu)及編碼特性綜上所述,PEDV的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA。其中Pol基因在病毒感染早期發(fā)揮重要作用,S基因被認為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原ORF3基因與病毒毒力有關(guān),sM基因在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關(guān)重要的作用,M基因編碼的Mu2005蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原,又鑒于冠狀病毒N蛋白保守性強,所以利用N基因編碼的N蛋白來建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。但豬流行性腹瀉病毒全基因組結(jié)構(gòu)還需要深入研究。疫苗研制的最佳構(gòu)想應(yīng)該包括安全、有效果、多價、成本低及保存和使用方便等,但要達到上述目標還需要一個漫長的過程。PED疫苗的研究已經(jīng)取得了一些可喜的進展,隨著人們對病毒致病原認識的不斷深入,研制的PED疫苗也在不斷完善,相信不久的將來科學(xué)家們會研制出特別有效的疫苗來控制PED疾病的發(fā)生。PEDV基因組是單股正鏈具有感染性的RNA,與其他冠狀病毒相似,其基因組5′端有一個帽子結(jié)構(gòu)(cap),3′端有一個Poly(A尾,基因組全長為28u2005033u2005nt(PEDVCV777毒株)?；蚪M5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)位于復(fù)制酶多聚蛋白基因上游