應(yīng)用16srrnardna基因檢測(cè)小鼠糖尿病模型腸道菌群

應(yīng)用16srrnardna基因檢測(cè)小鼠糖尿病模型腸道菌群

體腸菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。由于細(xì)菌培養(yǎng)手段的局限性，我們對(duì)其結(jié)構(gòu)和組成知之甚少。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)在感染微生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用,根據(jù)細(xì)菌16SrRNA序列的分類,發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)寄住的微生物群的種類超過800種。近年來,有關(guān)腸道菌群與機(jī)體代謝平衡方面又提出了一個(gè)新觀點(diǎn):2型糖尿病和肥胖與高脂飲食所激發(fā)的機(jī)體輕度炎癥反應(yīng)密切相關(guān),也發(fā)糖尿病病人血清中脂多糖升高,這很有可能是,腸道菌群和糖尿病相互作用的結(jié)果。本研究根據(jù)不同細(xì)菌的16SrDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)糖尿病小鼠腸道菌群中的雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、腸球菌屬和大腸桿菌這幾種代表菌屬進(jìn)行定量分析,比較糖尿病小鼠與正常對(duì)照之間的腸道菌群差異。一、材料和方法1.細(xì)菌基因組dna抽提三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、無水乙醇(均為上?；瘜W(xué)試劑廠);標(biāo)準(zhǔn)菌株(學(xué)校保存購于北京生物制品所);十二烷基硫酸鈉(SDS)、蛋白酶K、溶菌酶、柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(均購自上海生物工程公司);DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker及TaqDNA多聚酶(購自Qiagen公司)。2.stz注射有效模型清潔級(jí)昆明小鼠(18-22g),雄性,由杭州師范大學(xué)動(dòng)物中心提供。小鼠空腹18h,腹腔注射STZ(80mg/kg),72h后以相同劑量加強(qiáng)注射1次。4周后,以血糖值>11mmol/L為造模成功標(biāo)準(zhǔn),隨機(jī)取15只小鼠作為模型組,另15只不做STZ注射,作為正常對(duì)照組。再飼養(yǎng)8周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.測(cè)試方法(1)細(xì)菌基因組dna的制備以無菌方法取小鼠的新鮮糞便,置于無菌試管內(nèi),并迅速置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存。稱取0.2g糞便標(biāo)本中加200μL含溶菌酶的TE(溶菌酶濃度20mg/mL),用移液尖混勻。室溫下孵育40min加入試劑盒中提供的消化緩沖液400μL,混勻;再加入3μL蛋白酶K,混勻后55℃保溫2-3h。離心,上清液加入260μL無水乙醇,混勻后轉(zhuǎn)至細(xì)菌基因組DNA抽提柱中。離心、重復(fù)3次,離心管中收集的液體即為細(xì)菌基因組DNA。(2)乳酸桿菌屬及腸球形屬5雙歧桿菌屬(350bp)F:5′ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAA3′;R:5′GGCACAATCCGCTGGCAACA3′。乳酸桿菌屬(165bp)F:5′ACGGGAGGCAGCAGTAGGGA3′;R:5′AGCCGTGACTTTCTGGTTGATT3′。腸球菌屬(274bp)F:5′TCCACGCCGTAAACGATGAG3′;R:5′GACACGAGCTGACGACAACC3′。大腸桿菌(317bp)F:5′GGAGCAAACAGGATTAGATACCC3′;R:5′AACCCAACATTTCACAACACG3′。(3)確定od值及濃度以各標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)切膠、回收后所得的DNA片段作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值及濃度,換算為各標(biāo)準(zhǔn)品1μL的拷貝數(shù)(長雙歧桿菌2.66×1011,嗜酸乳桿菌1.85×1011,大腸桿菌1.70×1011,糞腸球菌3.88×1011),用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)pcr反應(yīng)體系將待測(cè)糞便樣品中提取的DNA分別進(jìn)行4種細(xì)菌16SrDNA熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)相同。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對(duì)照,每個(gè)樣品均同時(shí)做3個(gè)平行復(fù)孔。反應(yīng)完畢后根據(jù)融解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法樣品定量數(shù)據(jù)導(dǎo)入Prism5.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)比較組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二、結(jié)果1.體重、糖尿病大鼠血糖情況體重從開始實(shí)驗(yàn)始到12周結(jié)束,糖尿病組小鼠體重明顯比正常組輕(P<0.01),糖尿病組小鼠血糖明顯比正常組高(P<0.01)。2.實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)每份糞便標(biāo)本所含的4種細(xì)菌的拷貝數(shù)可通過Ct值與標(biāo)準(zhǔn)菌株的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到,由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀通過系統(tǒng)內(nèi)置的軟件處理后直接給出定量結(jié)果(附表)。三、srrna實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)在人身體的體表及其與外界相通的腔道,如口腔、鼻腔系統(tǒng)、咽喉腔、眼結(jié)合膜、腸道及泌尿生殖道等部位都有大量的微生物的存在,其中一部分為長期寄居的微生物,在機(jī)體防御機(jī)能正常時(shí)是無害的,稱為正常菌群或正常微生物群。正常菌群對(duì)人體有益無害,而且是必須的。正常菌群是由相當(dāng)固定的細(xì)菌組成,有規(guī)律地定居于身體一些特定部位,成為身體的一個(gè)組成部分。這些益生菌是通過口服的活的細(xì)菌,數(shù)量豐常多,能在結(jié)腸定植。16srRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列,存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。16srRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個(gè)功能域)。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn)及核酸研究技術(shù)的不斷完善,16srRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。數(shù)據(jù)庫的不斷完善,應(yīng)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡便地分類鑒定和檢測(cè)。該技術(shù)主要有三個(gè)步驟:首先是基因組DNA的獲得,其次是16srRNA基因片段的獲得,最后是進(jìn)行16srRNA基因序列的分析。本實(shí)驗(yàn)室16SrRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立,將為正確定量檢測(cè)腸道中的細(xì)菌菌群數(shù)量提供一種特異性高、敏感性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)方法。CANI等通過研究發(fā)現(xiàn),先給小鼠高脂飲食誘導(dǎo)其腸道菌群紊亂,然后補(bǔ)充益生元乳果糖,發(fā)現(xiàn)腸道雙歧桿菌數(shù)量可以恢復(fù)。而雙歧桿菌可以降低腸道內(nèi)毒素水平,提高腸黏膜屏障功能,改善由高脂飲食所誘發(fā)的糖尿病。在喂食纖維性益生元的小鼠顯示血漿內(nèi)毒素水平正常,糖耐量提高,胰島素釋放正常。ARTIN等在給定植有嬰兒腸道菌群的無菌小鼠喂食益生菌后,導(dǎo)致了一系列組織代謝的改變,從而影響機(jī)體的能量、脂肪和氨基酸代謝。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明了腸道菌群在維護(hù)機(jī)體代謝平衡中所起的作用。通過補(bǔ)充益生菌雙歧桿菌,能有效減輕人體體重增加、肝脂肪性變及其他相關(guān)的代謝性紊亂。除了腸道菌群對(duì)機(jī)體能量和代謝的調(diào)節(jié),腸道菌群通過改變食物成分可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種代謝變化,而這種變化有時(shí)有利于健康,有時(shí)也可以產(chǎn)生相反的效果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高脂飲食能夠有效改變腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群,其中雙歧桿菌、球菌和類桿菌減少,這有助于G-/G+菌比例的增加。因此血漿中LPS升高、肝臟糖原沉