鎖陽(yáng)熊果酸乙醇提取工藝研究

鎖陽(yáng)熊果酸乙醇提取工藝研究

香陽(yáng)是多年生、完整的種子植物。這種植物是一種肉質(zhì)和棕棕色的植物，通常屬于白刺科。鎖陽(yáng)是一種常用中藥材,性甘、溫,具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、益精血、潤(rùn)腸通便、養(yǎng)筋之功用。研究表明,鎖陽(yáng)具有增強(qiáng)免疫、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、防治心血管疾病、抗應(yīng)激、抗胃潰瘍、促進(jìn)機(jī)體性成熟等作用。鎖陽(yáng)中含有黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)類、多糖、氨基酸、有機(jī)酸、甾體類等活性成分。熊果酸(Ursolicacid),又名烏蘇酸、烏索酸、α-香樹(shù)脂醇,是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物。熊果酸具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗菌抗病毒、降血脂、降血壓、抗氧化、抗艾滋病等作用。熊果酸的提取方法有回流提取法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界萃取法、索氏提取法、滲漉法等。目前關(guān)于鎖陽(yáng)熊果酸的提取工藝研究鮮有報(bào)道,本研究以甘肅敦煌地區(qū)產(chǎn)的鎖陽(yáng)為原料,采用響應(yīng)面法優(yōu)化鎖陽(yáng)熊果酸的乙醇回流提取工藝,為鎖陽(yáng)的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1鎖陽(yáng)科鎖陽(yáng)屬植物鎖陽(yáng)鎖陽(yáng),取自甘肅敦煌,經(jīng)吉林工程技術(shù)師范學(xué)院生物工程教研室李皓教授鑒定為鎖陽(yáng)科鎖陽(yáng)屬植物鎖陽(yáng)(CynomoriumsongaricumRupr.);熊果酸(純度≥98%),成都曼思特生物科技有限公司;甲醇、乙醇、乙腈,色譜純,天津市康科德科技有限公司;磷酸,優(yōu)級(jí)純,北京化工廠。1.2儀器、設(shè)備和儀器Agilent1260液相色譜儀(WondaSilC18色譜柱4.6nm×150nm,5μm,DAD檢測(cè)器,安捷倫科技有限公司),FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)型臺(tái)式四表四抽循環(huán)水真空泵(上海標(biāo)和儀器有限公司),HWS-24電熱恒溫水浴箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),AL104電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司],RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),DHG-9075A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。1.3方法1.3.1流動(dòng)相v色譜柱WondaSilC18分析柱(4.6nm×150nm,5μm),流動(dòng)相V(甲醇)∶V(0.5%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=80∶15∶5,流速1mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL,數(shù)據(jù)處理為外標(biāo)法峰面積定量。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品和鎖陽(yáng)熊果酸的HPLC色譜峰見(jiàn)圖1。1.3.2熊羧酸的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。稱取熊果酸對(duì)照品4.10mg,置于10mL容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,得含熊果酸0.41mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0mL,置10mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。測(cè)定時(shí)進(jìn)樣量10μL。繪制峰面積—對(duì)照品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:y=3.86455x-5.63485,R2=0.99891,熊果酸在0.082~0.82μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。1.3.3熊乳酸提取量的測(cè)定將鎖陽(yáng)干燥,粉碎,過(guò)篩網(wǎng)孔徑0.25mm的標(biāo)準(zhǔn)篩。稱取5.00g鎖陽(yáng)粉末,乙醇回流提取,過(guò)濾,濾液減壓濃縮,然后在水浴上蒸發(fā)至干,殘?jiān)眉状既芙?定容至10mL,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò),按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定提取液中熊果酸濃度,計(jì)算熊果酸提取量,公式:熊果酸提取量(mg/g)=提取液中熊果酸質(zhì)量(mg)/原料質(zhì)量(g)。1.3.4熊羧酸提取試驗(yàn)(1)單因素試驗(yàn)。設(shè)定乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)75%,液料比15∶1(mL∶g),提取溫度85℃,提取時(shí)間1.5h,提取1次,固定其他條件,分別考察乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)(35%,45%,55%,65%,75%,85%,95%)、提取溫度(35,45,55,65,75,85,95℃)、提取時(shí)間(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0h)、液料比(9∶1,12∶1,15∶1,18∶1,21∶1,24∶1,27∶1)對(duì)熊果酸提取量的影響。(2)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn),采用軟件DesignExpert8.0.7.1處理數(shù)據(jù),優(yōu)化鎖陽(yáng)熊果酸的乙醇回流提取工藝。(3)提取次數(shù)的確定。在最佳提取工藝條件下,取1份鎖陽(yáng)粉末,反復(fù)提取至檢測(cè)不出熊果酸,測(cè)定鎖陽(yáng)熊果酸的含量,考察提取次數(shù)對(duì)熊果酸提取量的影響。2結(jié)果與分析2.1單因素試驗(yàn)2.1.1熊乳酸/乙醇溶液相互作用由圖2可見(jiàn),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大,熊果酸的提取量增加。原因可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,乙醇溶液的極性也逐步減弱,而熊果酸屬于五環(huán)三萜類非極性物質(zhì),根據(jù)相似相溶原理,熊果酸易溶于純的乙醇溶液中。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%后,熊果酸提取量增加較小,考慮到成本問(wèn)題,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%~85%較為適宜。2.1.2溫度對(duì)熊乳酸分散液的影響由圖3可見(jiàn),隨著提取溫度的升高,熊果酸提取量增加。曲線呈上升趨勢(shì)的原因是,隨著溫度的升高,分子的運(yùn)動(dòng)速度加快,這有利于熊果酸從鎖陽(yáng)粉末中溶出并分散到溶液中。當(dāng)溫度升高到75℃以后,曲線上升緩慢,因此將提取溫度控制在65~85℃較好。2.1.3熊乳酸提取量由圖4可見(jiàn),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),熊果酸提取量先上升后下降。原因可能是提取時(shí)間過(guò)短,熊果酸不能及時(shí)充分地釋放到溶劑中,隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)表現(xiàn)為提取量增加;當(dāng)提取量達(dá)到最大值后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),除了熊果酸以外的其他醇溶性物質(zhì)的釋放量也在繼續(xù)增加,與熊果酸競(jìng)爭(zhēng)溶劑,導(dǎo)致熊果酸提取量下降。因此,熊果酸的提取時(shí)間為1~2h較為適宜。2.1.4溶劑用量對(duì)鎖陽(yáng)熊羧酸提取量的影響一般而言,液料比是傳質(zhì)推動(dòng)力的直接體現(xiàn),隨著液料比的增加,傳質(zhì)推動(dòng)力增大,整個(gè)溶媒的傳質(zhì)過(guò)程加快。由圖5可見(jiàn),隨著溶劑用量增加,鎖陽(yáng)熊果酸的提取量先增加后減少,原因可能是,隨著溶劑用量增加,溶質(zhì)的釋放量增加,液料比達(dá)到15∶1(mL∶g)以后,熊果酸以外的其他醇溶性溶質(zhì)在溶劑中所占比例加大,導(dǎo)致熊果酸量減少。因此,從節(jié)省溶劑和保證提取量的角度綜合考慮,選擇液料比為12∶1~18∶1較好。2.2反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果2.2.1熊乳酸提取工藝條件對(duì)最佳條件的預(yù)測(cè)以熊果酸的提取量為響應(yīng)值,在提取1次的基礎(chǔ)上,以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表1和表2)。采用軟件DesignExpert8.0.7.1對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到回歸方程:Y=5.37+0.2158X1+0.1433X2-0.0225X3+0.0033X4+0.02X1X2+0.0175X1X3+0.005X1X4+0.0075X2X3-0.0125X2X4-0.0725X3X4-0.2454X12-0.1617X22-0.1729X32-0.1767X42。由表3可知,模型的P<0.0001,模型是極顯著的;失擬誤差的P>0.05,表現(xiàn)為不顯著;R2=0.9824,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有98.24%來(lái)源于所選變量。因此,該模型擬合程度較好,可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)熊果酸提取工藝條件。X1、X2、X3X4、X12、X22、X32、X42對(duì)熊果酸提取量的影響顯著,其他項(xiàng)不顯著,因此各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系;各因素對(duì)熊果酸提取量的影響大小順序:乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>液料比。2.2.2交互作用分析響應(yīng)面的陡緩程度可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。響應(yīng)面比較陡表示兩因素交互作用顯著,響應(yīng)面比較緩表示交互作用不顯著。由圖6可見(jiàn),X3X4交互作用顯著,各因素對(duì)熊果酸提取量影響的大小順序?yàn)閄1>X2>X3>X4,與方差分析結(jié)果一致。2.2.3熊乳酸提取量的預(yù)測(cè)值回歸模型預(yù)測(cè)的熊果酸提取工藝條件:乙醇體積分?jǐn)?shù)79.7%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.6h、液料比13.6∶1(mL∶g),熊果酸提取量的預(yù)測(cè)值為5.4mg/g?？紤]提取條件的可操作性,將工藝條件修改為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.6h、液料比14∶1,進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),熊果酸的提取量為5.38mg/g,預(yù)測(cè)值和實(shí)際值之間的誤差0.37%,證明了響應(yīng)面法優(yōu)化熊果酸提取工藝的可行性。2.3鎖陽(yáng)樣品中熊《果粉》含量的測(cè)定由圖7可見(jiàn),隨著提取次數(shù)的增加,鎖陽(yáng)殘?jiān)行芄岬臍埩袅吭絹?lái)越少,提取至第5次時(shí),已經(jīng)檢測(cè)不到熊果酸。由此得出,鎖陽(yáng)樣品中熊果酸的含量為6.58mg/g。每次提取出來(lái)的熊果酸占總量的比例分別為81.76%、15.96%、2.13%、0.15%、0,提取2次的總提取量為6.43mg/g,總提取率達(dá)到97.72%,此時(shí)鎖陽(yáng)中的熊果酸大部分被提取出來(lái),從節(jié)省溶劑和后期濃縮純化角度考慮,提取次數(shù)確定為2次。3提取工藝的研究本研究利用DesignExpert8.0.7.1軟件對(duì)影響鎖陽(yáng)熊果酸乙醇回流提取工藝的各個(gè)因素進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,各因素對(duì)熊果酸提取量的影響大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間>液料比;各因素的最佳值:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.6h、液料比14∶1、提取2次,此條件下,鎖陽(yáng)熊果酸的提取量為6.43mg/g,提取率為97.72%。熊果酸是鎖陽(yáng)的有效成分,目前關(guān)于鎖陽(yáng)熊果酸的提取工藝研究報(bào)道有超聲波法、索氏提取法,而關(guān)于鎖陽(yáng)熊果酸的乙醇回流提取工藝研究未見(jiàn)報(bào)道。參照文獻(xiàn)[13,22]的提取方法,對(duì)取自甘肅敦煌的鎖陽(yáng)進(jìn)行熊果酸提取,