芒柄花苷對人體腸道細(xì)菌生長的影響

芒柄花苷對人體腸道細(xì)菌生長的影響

人體腸道菌群對藥物的代謝影響與藥物對腸道菌群生長的影響有關(guān)。正常情況下,不同菌種間相互依存、相互制約,在質(zhì)和量上形成一種動態(tài)生物平衡,構(gòu)成了腸道的生物屏障,是人體保持健康狀態(tài)的一個重要環(huán)節(jié)。倘若疾病或藥物濫用等情況會導(dǎo)致敏感腸道菌的生長被抑制,而未被抑制的腸道菌就會趁機(jī)大量快速繁殖,從而引起腸道菌群失調(diào),而腸道的菌群失調(diào)又可加重病情或誘發(fā)多種疾病。因此安全性高的口服藥物不僅對機(jī)體本身無嚴(yán)重不良反應(yīng),而且對腸道微生物群的平衡也不應(yīng)有嚴(yán)重影響。目前關(guān)于腸道細(xì)菌對藥物的代謝研究較多,藥物對腸道細(xì)菌生長影響的研究卻鮮見報道。換言之,偏重于藥物經(jīng)腸道細(xì)菌代謝后代謝產(chǎn)物的尋找及其活性的研究,忽略了藥物及其代謝產(chǎn)物對腸道細(xì)菌生長以及可能對機(jī)體健康狀況產(chǎn)生的影響研究。芒柄花苷是中藥黃芪、甘草、紅芪、葛根等藥材中黃酮類化合物的代表性成分,具有促進(jìn)皮膚生長、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、維持血中NO濃度和保護(hù)缺血再灌注損傷、增強(qiáng)免疫等多種藥理活性。目前,已有大量關(guān)于灌胃補(bǔ)陽還五湯或當(dāng)歸補(bǔ)血湯后大鼠血漿中芒柄花苷的藥代動力學(xué)研究的報道,但有關(guān)人體腸道細(xì)菌對芒柄花苷的代謝和芒柄花苷對人體腸道細(xì)菌生長的影響研究都未見報道。本文采用超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC-Q-TOF/MS)與MetabolynxTM軟件尋找芒柄花苷與人體腸道混合菌及分離的單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物;采用選擇性培養(yǎng)基分別培養(yǎng)得到人體代表性的4類細(xì)菌(腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌),并采用光比濁法測定加入不同濃度芒柄花苷溶液后這4類細(xì)菌的生長變化,從而推測芒柄花苷對人體腸道菌群平衡的影響,為揭示服用含有芒柄花苷成分的中藥體內(nèi)作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù),也可為相似研究提供借鑒。細(xì)菌分離、培養(yǎng)儀器與試藥UPLCAcquityTM系統(tǒng)(Waters公司);SynaptTMQ-TOF質(zhì)譜儀(Waters公司),配有電噴霧離子源(ESI);Masslynx4.1質(zhì)譜工作站軟件(Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);PerkbnElmer酶標(biāo)儀(Enspire公司)。伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(編號:HB0107)、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基(編號:HB0133)、雙歧桿菌BS培養(yǎng)基(編號:HB0394)、乳酸桿菌LBS培養(yǎng)基(編號:HB0385)均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;芒柄花苷(純度>98%)購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司(批號:130531);乙腈(Tedia)色譜純;甲酸(Merck)色譜純;其余試劑為分析純。普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制及滅菌精密稱取胰蛋白胨10.00g、大豆蛋白胨3.00g、朊胨10.00g、酵母浸膏5.00g、血清消化粉13.50g、牛肝浸出粉1.20g、牛肉膏2.20g、葡萄糖3.00g、KH2PO42.50g、NaCl3.00g、可溶性淀粉5.00g、L-半胱氨酸鹽0.30g和硫代乙醇酸鈉0.30g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH7.2并最終定容至1L。精密稱取NaCl2.70g用超純水定容至300mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃高壓蒸汽滅菌20min,冷卻后用于人體腸道細(xì)菌的分離。選擇性培養(yǎng)基的配制及滅菌精密稱取伊紅美蘭瓊脂干粉37.40g和腸球菌瓊脂干粉56.25g,分別加熱溶解于1L蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min,冷卻至適宜溫度,分別用于腸桿菌和腸球菌的分離;精密稱取雙歧桿菌BS培養(yǎng)基68.90g,再吸取1.0mL的吐溫-80,加熱溶解于1L蒸餾水中,116℃高壓滅菌30min,冷卻至適宜溫度后用于雙歧桿菌的分離;精密稱取乳酸桿菌LBS培養(yǎng)基84.00g,再吸取1.0mL的吐溫-80,加熱溶解于1L蒸餾水中,118℃高壓滅菌15min,冷卻至適宜溫度后再加入冰醋酸1.3mL,充分混合,用于乳酸桿菌的分離。對照品溶液的配制精密稱取芒柄花苷對照品適量,用超純水超聲溶解,配制成5.0mg·mL-1的對照品溶液,于4℃保存?zhèn)溆?。人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0g,與生理鹽水按比例1∶4(g∶mL)混合,渦旋2min制成混懸液,再1000r·min-1離心10min得上清液,即為腸道菌液。將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取適當(dāng)濃度的稀釋液0.1mL分別接種在GAM瓊脂平板上,均勻涂布,并在37℃厭氧下培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,最終分離出69種細(xì)菌,分別標(biāo)號為sp.1~sp.69。另外,通過選擇性培養(yǎng)基分別分離出腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌。將以上分離得到的各種細(xì)菌保存于4℃待用。含藥腸道菌液的厭氧共培養(yǎng)及細(xì)菌供試液的制備將混合菌及各單菌分別接種在含有1.0mL厭氧培養(yǎng)液的離心管中,37℃條件下厭氧培養(yǎng)24h,即得到細(xì)菌種子液。取出渦旋1min,用生理鹽水連續(xù)10倍稀釋兩次,從最終稀釋液中吸取0.1mL加到0.9mL厭氧培養(yǎng)液中(每份培養(yǎng)液均含8.6μL芒柄花苷對照品溶液)。每種細(xì)菌平行做3份,并在37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h。同時做空白對照實(shí)驗(yàn)。48h后取出含藥腸道菌液,將每種細(xì)菌的3份平行培養(yǎng)液合并,以1~1.5倍的乙酸乙酯反復(fù)萃取3次,且合并各自萃取后的上清液。上清液在50℃烘箱中烘干,再用0.3mL甲醇超聲復(fù)溶,13000r·min-1離心10min后吸取上清液,作為細(xì)菌樣品的供試液。色譜-質(zhì)譜條件AcquityUPLCBEHC18色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm);流動相:乙腈(A)和0.1%甲酸(B),梯度洗脫(0~7.5min,10%~40%A;7.5~9min,40%~90%A;9~10min,90%A;10~12min,10%A),柱溫35℃,流速0.4mL·min-1,進(jìn)樣量5μL。ESI源,掃描方式:ESI-模式;毛細(xì)管電壓:2kV;錐孔電壓:40V;離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:350℃;錐孔氣流量:50L·h-1;脫溶劑氣流量:600L·h-1;碰撞能量(6~40V);質(zhì)量掃描范圍:m/z100~1000;準(zhǔn)確質(zhì)量測定采用蘆丁溶液為鎖定質(zhì)量溶液;數(shù)據(jù)采集模式:碰撞能量梯度(MSE);數(shù)據(jù)分析:質(zhì)量虧損過濾(MDF)。代謝產(chǎn)物的鑒定與分析將芒柄花苷可能的Ⅰ相代謝途徑如:還原、氧化、羥化、羥化甲基化等;可能的Ⅱ相代謝途徑如:甲基化、乙?；?、磺酸化、羥化再磺酸化、葡糖醛酸化、羥化再葡糖醛酸化、磺酸化葡糖醛酸化、雙葡糖醛酸化等輸入MetabolynxTM軟件MetaboliteList窗口中,質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測誤差范圍<10mDa。菌種活化無菌條件下,將斜面保藏的菌種接種在普通厭氧培養(yǎng)液中,并在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取活化后的新鮮菌液離心棄去普通厭氧培養(yǎng)液,用生理鹽水依次做10倍梯度稀釋。取濃度為1×108CFU·mL-1的菌懸液備用。芒柄花苷紫外可見區(qū)吸收曲線掃描精密稱取芒柄花苷對照品1.50mg溶解于體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶劑中,配制成合適濃度的芒柄花苷溶液,以空白溶液作為參比,用分光光度計在波長200~900nm間進(jìn)行掃描。菌懸液的準(zhǔn)備及光學(xué)密度(OD)值的測定取相同生長期的4種受試菌各100μL,濃度為1×108CFU·mL-1,分別加到1mL含不同濃度芒柄花苷(10、50和100μg·mL-1)的普通厭氧培養(yǎng)液中。從上述芒柄花苷-普通厭氧培養(yǎng)菌懸液中各取250μL于96孔板上,同樣體積不含芒柄花苷的菌懸液作空白對照,以僅含液態(tài)培養(yǎng)基的孔為參比,用酶標(biāo)儀在600nm波長,37℃條件下測定其OD值。測定后將96孔板用保鮮膜包好加蓋大小合適的鋁箔,以保持水分并防止外界污染。包好的96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2h測定并記錄菌懸液的OD值,直至細(xì)菌生長達(dá)到穩(wěn)定期。數(shù)據(jù)處理與分析所有實(shí)驗(yàn)均平行3份進(jìn)行,數(shù)據(jù)處理采用GraphPadPrism5.0軟件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ue0af±s表示,P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著性差異。結(jié)果1人體腸道細(xì)菌作用后的藥劑代謝產(chǎn)物MetabolynxTM軟件以質(zhì)量丟失濾過(MDF)處理為基礎(chǔ),根據(jù)采集的數(shù)據(jù)及設(shè)置的處理方法進(jìn)行自動分析。經(jīng)該軟件處理后,檢測到的經(jīng)人體腸道細(xì)菌作用后的芒柄花苷的代謝產(chǎn)物共7個,見表1。此外,發(fā)現(xiàn)混合菌以及單菌sp.23、sp.41-1、sp.45、sp.46、sp.52和sp.75能將芒柄花苷進(jìn)行特定的代謝轉(zhuǎn)化,分別檢測到M1和M8(混合菌)、M4(sp.23)、M3(sp.41-1)、M6(sp.45)、M7(sp.46)、M2(sp.52)、M5(sp.75)。1.11m活性物質(zhì)1.2去甲基化產(chǎn)物2m1.3產(chǎn)品為3m1.4產(chǎn)子4m1.7羥基甾醇m71.8優(yōu)化作用后的代謝途徑上述各代謝物的二級質(zhì)譜以及其可能的裂解途徑見圖1。芒柄花苷經(jīng)腸道細(xì)菌作用后可能的代謝途徑見圖2。綜上,通過體外糞便溫孵法及超高效液相四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜手段檢測到了芒柄花苷經(jīng)人體腸道細(xì)菌作用后的7個代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明,芒柄花苷在不同種的細(xì)菌作用下會發(fā)生不同類型的代謝轉(zhuǎn)化。2添加不同濃度天然氣柄花苷對病原菌腸蚤桿菌生長的影響對于菌懸液,理論上測定波長λ可以取任意波長,但要注意避開芒柄花苷的強(qiáng)吸收區(qū)域。因芒柄花苷的可見區(qū)無明顯吸收,在480~620nm之間吸收曲線相對平滑,故選擇600nm作為檢測波長。采用酶標(biāo)儀測定加入不同濃度芒柄花苷后上述4類細(xì)菌的生長情況,具體見圖3。結(jié)果表明,芒柄花苷對病原菌腸球菌和腸桿菌有生長抑制作用,而且抑制作用通常會隨著芒柄花苷濃度的升高而增強(qiáng),在芒柄花苷濃度為10μg·mL-1時抑制程度較弱,當(dāng)濃度為100μg·mL-1時抑制程度達(dá)到最大;芒柄花苷對有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌有生長促進(jìn)的作用,且此作用會隨著芒柄花苷濃度的升高而減弱,在芒柄花苷濃度是10μg·mL-1時促進(jìn)程度最強(qiáng),但當(dāng)濃度達(dá)到100μg·mL-1時會呈現(xiàn)一定程度的生長抑制作用,提示芒柄花苷會影響腸道菌群的平衡且影響程度與細(xì)菌的種類及藥物的濃度有關(guān)。檢測互聯(lián)互通的機(jī)制中藥中多數(shù)苷類成分在口服后因親脂性低而吸收較差不易轉(zhuǎn)運(yùn)到靶部位以至影響其發(fā)揮作用。文獻(xiàn)報道苷由腸道細(xì)菌作用后的代謝產(chǎn)物通常極性減小,脂溶性增加,小腸吸收入血的速度由此加快而能較快達(dá)到所需血藥濃度,發(fā)揮其藥效作用。由圖2可看出,芒柄花苷M1經(jīng)人體腸道細(xì)菌作用后直接脫糖轉(zhuǎn)化為苷元M8,且中間產(chǎn)物M2~M4最終分別轉(zhuǎn)化為代謝物M5~M7。由保留時間可知代謝物M5~M8的極性均減小,故推測可能會有利于其在腸道內(nèi)的吸收。大量研究表明苷元芒柄花素具有顯著的藥理活性,如芒柄花素具有雌激素樣作用及對生殖系統(tǒng)具有一定的安全性,能夠調(diào)節(jié)血脂代謝及改善動脈粥樣硬化病變,還具有清除氧自由基、血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用。此外,芒柄花素還應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療。本實(shí)驗(yàn)通過不同的選擇性培養(yǎng)基篩選出了人體腸道中致病的腸球菌、腸桿菌及有益的雙歧桿菌、乳酸桿菌作為測試對象,這4類優(yōu)勢代表菌種間的平衡關(guān)系與人體健康有著密切聯(lián)系。其中,雙歧桿菌與乳酸桿菌是人腸道內(nèi)最常見也是最重要的益生菌群,參與宿主的營養(yǎng)、代謝、免疫等過程,對維持宿主健康起著重要的作用。已有報道稱雙歧桿菌和乳酸桿菌在腸道上形成生理屏障,代謝出大量乳酸和乙酸,抑制了致病菌的生長,發(fā)揮生物拮抗作用;人體腸道中的腐生菌在分解食物、膽汁過程中產(chǎn)生酚類、吲哚、甲基吲哚、有機(jī)胺、氨、糞臭素和硫化氫等致癌代謝產(chǎn)物,而雙歧桿菌和乳酸桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸和乙酸能加速腸道蠕動和通便,促使這些致癌物質(zhì)排出體外而解毒。據(jù)文獻(xiàn)報道,酚酸類化合物能夠被雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌作為營養(yǎng)基質(zhì)并轉(zhuǎn)化利用為自身細(xì)胞提供能量,同時酚酸類化合物也是腸球菌和腸桿菌等有害菌中丙烯酰胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶的一種有效的非競爭性抑制劑。因此,芒柄花苷可能基于以上兩種機(jī)制而具有促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌生長和抑制腸球菌和腸桿菌生長的作用。在混合菌樣品中存在準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-(m/z429)的化合物M1(tR=4.94min),在二級質(zhì)譜中有m/z267[M-Glu]-、m/z159、m/z135等主要碎片離子峰,與芒柄花苷對照品相同,由此確定為芒柄花苷。在52號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中,代謝產(chǎn)物M2(tR=2.50min)的準(zhǔn)分子離子峰([M-H]-)m/z為415,比芒柄花苷的準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z429)少14u,說明M2可能為芒柄花苷結(jié)構(gòu)中脫去了一分子甲基(-14u)而形成的代謝產(chǎn)物。對M2進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,主要有M2的準(zhǔn)分子離子經(jīng)脫糖后產(chǎn)生的m/z253碎片離子,m/z135和m/z159的碎片離子分別是由m/z253的碎片離子經(jīng)RDA裂解和丟失B-環(huán)后所生成。故推測M2為芒柄花苷經(jīng)52號細(xì)菌作用后的去甲基化產(chǎn)物。在41-1號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中,代謝產(chǎn)物M3(tR=3.06min)的準(zhǔn)分子離子峰([M-H]-)m/z為445,比芒柄花苷的準(zhǔn)分子離子[M-H]-(m/z429)多16u,說明M3可能為芒柄花苷結(jié)構(gòu)中加上了一分子羥基(+16u)而形成的代謝產(chǎn)物。對M3進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,其主要碎片離子峰有m/z429,283,267,147,135。根據(jù)裂解規(guī)律可以推斷出:準(zhǔn)分子離子m/z445脫羥基后產(chǎn)生m/z429的碎片離子,m/z429離子脫去糖基后產(chǎn)生m/z267的碎片離子,m/z267離子通過RDA裂解反應(yīng)進(jìn)一步產(chǎn)生m/z135的碎片離子;準(zhǔn)分子離子m/z445脫去糖基后產(chǎn)生m/z283的碎片離子,m/z283的離子通過RDA裂解反應(yīng)進(jìn)一步產(chǎn)生m/z147和m/z135的碎片離子。由此分析M3應(yīng)是芒柄花苷的羥基化產(chǎn)物,且羥基加在M3的B環(huán)上。在23號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中,代謝產(chǎn)物M4(tR=3.52min)的準(zhǔn)分子離子峰([M-H]-)m/z為431,推測可能為芒柄花苷的氫化產(chǎn)物。對M4進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,其主要碎片離子峰有m/z429,269,159,133。根據(jù)裂解規(guī)律可以推斷出:準(zhǔn)分子離子m/z431脫去糖基后產(chǎn)生m/z269的碎片離子,m/z135和m/z159的碎片離子分別是由m/z269的碎片離子經(jīng)RDA裂解和丟失B-環(huán)后所生成。故推測M4為芒柄花苷經(jīng)23號細(xì)菌作用后的氫化產(chǎn)物。1.5md-pcr質(zhì)譜特性在75號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中,代謝產(chǎn)物M5(tR=4.97min)的準(zhǔn)分子離子峰([M-H]-)m/z為253,推測可能為去甲基化后的苷元。對M5進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,其主要碎片離子峰有m/z159,135,117。根據(jù)裂解規(guī)律可以推斷出:準(zhǔn)分子離子m/z253通過RDA裂解反應(yīng)產(chǎn)生了m/z135和m/z117的碎片離子,m/z159碎片離子是由m/z253的碎片離子經(jīng)丟失B-環(huán)后所生成。故推測M5為芒柄花苷經(jīng)75號細(xì)菌作用后形成的去甲基化的刺芒柄花素。1.6準(zhǔn)分子離子鑒定結(jié)果在45號樣品的一級全掃描質(zhì)譜中,代謝產(chǎn)物M6(tR=5.25min)的準(zhǔn)分子離子峰([M-H]-)m/z為283,推測可能為羥基化后的苷元。對M6進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,其主要碎片離子峰有m/z267,239