2型糖尿病高效造模方案的研究

2型糖尿病高效造模方案的研究

近年來，人民生活水平的提高、人口老化和生活方式的變化，2型糖尿病患者逐年增加，趨于老齡化。針對(duì)這一臨床病癥的治療藥物篩選越來越受重視,研究者較多。本實(shí)驗(yàn)正是為這種病癥的模型構(gòu)建提供一例高效方案,從而為糖尿病的發(fā)病機(jī)制和藥物防治研究提供較好的糖尿病模型。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)雄性SD大鼠(體質(zhì)量100±20g),雄性40只,購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.2試劑鏈脲佐菌素(STZ,SigmaUSA),0.1mol/L檸檬酸緩沖液pH=4.35(用三蒸水配置)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1大鼠飼料高糖高脂飼料按配方:20%市售豬油,20%白砂糖,60%普通老鼠飼料制作。制作時(shí)把普通老鼠飼料研碎成細(xì)小顆粒,將白砂糖和豬油用微波爐加熱熔解,最后把三者充分混勻做成小塊狀自然風(fēng)干或曬干。1.3.2高壓蒸汽滅菌配置STZ溶液前配好0.1mol/L檸檬酸緩沖液pH=4.35(用三蒸水配置)高壓蒸汽滅菌后置于4℃保存?zhèn)溆谩ＥR用時(shí)取稱適量STZ粉末配成1%檸檬酸緩沖液的溶液。1.3.3動(dòng)物體質(zhì)量和食物質(zhì)量將購(gòu)得的大鼠稱重,隨機(jī)挑選出8只分兩籠各自編號(hào)作為正常組給予普通老鼠飼料飼養(yǎng)。剩下的作為實(shí)驗(yàn)組且隨機(jī)分成8小組,各自分籠編號(hào)給予自制高糖高脂飼料飼養(yǎng)。所有大鼠每天稱重,按體質(zhì)量給食物。先按12g/100g體質(zhì)量給食物,觀察大鼠食量情況進(jìn)行食物/體質(zhì)量比例的調(diào)整,使兩組大鼠體質(zhì)量以接近且比較均衡的速度增長(zhǎng)(8~10周體質(zhì)量增至300g左右)。所有大鼠都有充足飲水,大鼠置于普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)每?jī)商旄鼡Q一次墊料。1.3.4stz溶液的配置在注射STZ溶液前對(duì)所有大鼠禁食(14~16h)不禁水,臨近注射STZ溶液時(shí)稱體質(zhì)量、測(cè)血糖。實(shí)驗(yàn)組大鼠按40mg/Kg劑量稱取STZ粉末進(jìn)行STZ溶液的配置,配置STZ溶液的操作應(yīng)在冰浴中完成,即STZ粉末、檸檬酸緩沖液、STZ溶液均應(yīng)放在冰浴中。STZ溶液在15min內(nèi)通過腹腔注射入大鼠體內(nèi)。注入STZ溶液后2h內(nèi)給實(shí)驗(yàn)組大鼠喂5%~10%濃度的白砂糖水溶液,避免大鼠因低血糖死亡。2h后將糖水換為涼白開水,防止出現(xiàn)酮癥酸中毒,白開水是為了防止糖尿病大鼠抵抗力下降因飲水不潔而造成感染出現(xiàn)死亡。2d所有大鼠均給普通飼料,2d后實(shí)驗(yàn)組大鼠恢復(fù)高糖高脂飼料,水為涼白開水。1.4觀測(cè)指標(biāo)1.4.1大鼠的一般情況前期飼養(yǎng)時(shí)主要留意大鼠的食量、水量和體質(zhì)量增長(zhǎng)情況,注射STZ溶液后注意觀察大鼠糞便,尿量(墊料潮濕程度),毛發(fā)情況。1.4.2腹部血糖的測(cè)定STZ注射后72h通過尾尖針刺取血進(jìn)行空腹血糖測(cè)定,于測(cè)定前1d晚8時(shí)禁食,測(cè)定當(dāng)天早上8時(shí)開始測(cè)定。1.5統(tǒng)計(jì)評(píng)估所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析。2結(jié)果2.1第1次注射stz在飼養(yǎng)63d時(shí)進(jìn)行第1次STZ注射,由于所用STZ為以前剩余的,已經(jīng)部分潮解失效,致第1次造模成模率很低,僅12.5%。因此在飼養(yǎng)74d時(shí)采用合格的STZ粉末配置溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)組未成模大鼠進(jìn)行第2次注射STZ,成模率為81.5%。第1、2次總成模率為83.9%。2.2第1次注射stz前2次注射stz前后1個(gè)月實(shí)驗(yàn)過程中大鼠體質(zhì)量的變化情況如圖1,分別是實(shí)驗(yàn)前、第1次注射STZ前、第2次注射STZ前、第2次注射STZ后1個(gè)月?？梢姷?次注射STZ后1個(gè)月實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量明顯減輕,對(duì)照組體質(zhì)量增加,有顯著差異性。2.3年齡大小。采用一般體積來運(yùn)輸,第1次造模,實(shí)驗(yàn)組32只大鼠4只血糖達(dá)到空腹高血糖值標(biāo)準(zhǔn),1只因體質(zhì)量較輕(僅150g)體質(zhì)很差死亡。第2次27只大鼠注射STZ,有22只達(dá)到空腹高血糖值標(biāo)準(zhǔn),無死亡。用第2次造模后的血糖數(shù)據(jù)進(jìn)行組間血糖值比較。正常組血糖(3.85±0.19)mmol/L,實(shí)驗(yàn)組血糖(17.80±7.61)mmol/L,與正常組比較,差異顯著,P<0.01。3實(shí)驗(yàn)大鼠的相關(guān)因素STZ是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糖尿病模型的常用誘發(fā)劑,能選擇性地破壞胰島B細(xì)胞,使胰島分泌功能受損甚至喪失,造成內(nèi)分泌功能紊亂,使糖、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝失調(diào),從而使血糖升高。然而,2型糖尿病模型的構(gòu)建成功與否,還與很多因素有關(guān),如:大鼠的體質(zhì)量、品種、性別、喂養(yǎng)方式、飼料的配比、STZ的劑量、給藥途徑、次數(shù)和禁食時(shí)間等。由于STZ成本很高,對(duì)于體質(zhì)量較輕、器官發(fā)育未成熟的大鼠一次注射劑量過大會(huì)導(dǎo)致死亡率很高。因此前期需要把大鼠飼養(yǎng)一段時(shí)間,待大鼠體質(zhì)量到300g左右時(shí)再行注射STZ溶液進(jìn)行模型構(gòu)建。因此選擇合適的劑量、大鼠體質(zhì)量、禁食時(shí)間等就很有必要。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂喂飼料養(yǎng)