宮頸病變組織中水通道蛋白1的表達(dá)

宮頸病變組織中水通道蛋白1的表達(dá)

水通道1（aqua-1，aqp1）是水通道蛋白質(zhì)（aquap1，aqps）的成員之一。此前發(fā)現(xiàn)了13種類型的母乳水通道蛋白質(zhì)（aqp0）aqp12。水通道蛋白于動(dòng)植物及微生物中普遍存在,選擇性地分布在與體液吸收或分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同液體跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中,執(zhí)行著各部位水分的重吸收、液體分泌和細(xì)胞內(nèi)外水環(huán)境穩(wěn)定的功能。它所介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn),是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。AQP1是第1個(gè)被鑒定的水通道蛋白,其分布范圍廣,于人紅細(xì)胞膜和大動(dòng)脈、小動(dòng)脈、毛細(xì)血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)。研究表明,它在多種腫瘤組織如黑色素瘤,乳腺癌,腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)升高,但未見在宮頸癌中的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的目的是了解AQP1在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌的表達(dá),探討AQP1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的意義。1材料和方法1.1患者的診斷背景收集2004年5月～2007年6月華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院手術(shù)切除或活檢的子宮頸組織標(biāo)本,包括25例慢性宮頸炎,27例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)和31例子宮頸癌組織。CIN27例中Ⅰ級(jí)9例,Ⅱ級(jí)10例,Ⅲ級(jí)8例。31例宮頸癌組織根據(jù)2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)宮頸腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期19例,Ⅱ期8例,Ⅲ期4例;病理學(xué)分級(jí):G16例,G211例,G314例;組織學(xué)分型:鱗癌24例,腺癌7例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例,未轉(zhuǎn)移23例;術(shù)前均無放、化療史。以上病例均經(jīng)2位病理醫(yī)生確定診斷。3組患者平均年齡38.3歲,38.9歲和36.9歲,無顯著差異(P>0.05)。所有標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定,常規(guī)組織處理,石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片。1.2辣根過氧化物酶的檢測兔抗人和鼠多克隆抗體(武漢博士德),免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù))。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育15min,以封閉內(nèi)源性辣根過氧化物酶,微波抗原修復(fù),正常血清封閉,加入抗Mcl-1(工作濃度1:200)抗體4℃孵育過夜,再用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG37℃孵育15min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37℃孵育15min,最后用DAB顯色,蘇木素復(fù)染,酒精逆度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。每一步驟間均用pH7.4PBS緩沖液漂洗3次,每次5min。以抗原陽性切片(卵巢癌組織)為陽性對(duì)照,PBS代替一抗為陰性對(duì)照。1.3觀察指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)AQP1免疫組化染色以胞膜被染呈棕黃色為陽性細(xì)胞,高倍鏡(×400)視野下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分,著色淡1分,著色適中2分,著色深3分。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野,計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占比例。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞數(shù)<10%0分,10%～30%1分,31%～60%2分,>60%3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加,0～1.0分(-),1.1～2.0分(+),2.1～3.0分(++),3.1～5.0分(+++)。(-～+)陰性,(++～+++)為陽性。1.4統(tǒng)計(jì)處理用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,率的比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1胞膜表達(dá)改變免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,AQP1只在慢性宮頸炎組織的微小動(dòng)脈、微小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜上表達(dá),CIN和宮頸癌組織中除微小動(dòng)脈、微小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膜上有表達(dá)外,在非典型增生的上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的膜上也有表達(dá)(圖1～3)。慢性宮頸炎組織AQP1陽性表達(dá)率4.0%(1/25),CIN組織陽性表達(dá)率33.3%(9/27),宮頸癌組織陽性表達(dá)率74.2%(23/31)。3組AQP1表達(dá)陽性率逐漸升高,宮頸癌組分別與慢性宮頸炎及CIN組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),慢性宮頸炎組與CIN組相比,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。2.2各組患者cin情況AQP1陽性表達(dá)率CINⅠ11.1%(1/9),CINⅡ40.0%(4/10),CINⅢ50.0%(4/8),組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。2.3病理學(xué)分級(jí)3gAQP1陽性表達(dá)率與宮頸癌臨床分期、組織學(xué)分型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05),病理學(xué)分級(jí)G1+G2表達(dá)水平顯著低于G3(P<0.05),見表3。3討論3.1aqp1蛋白的結(jié)構(gòu)人AQP1基因定位于染色體7P14,包含4個(gè)外顯子,分別編碼第1～128、129～183、184～210和211～269位氨基酸序列,其中3個(gè)內(nèi)含子的長度分別為9600、430和800bp。AQP1蛋白由269個(gè)氨基酸多肽組成,其非糖基化型分子的相對(duì)分子質(zhì)量28000,糖基化型分子的相對(duì)分子質(zhì)量35000～60000。AQP1蛋白分布廣泛,不僅存在于分泌及吸收型上皮細(xì)胞中,在毛細(xì)血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞中也很豐富。通過動(dòng)物及人體研究發(fā)現(xiàn),AQP1蛋白表達(dá)與毛細(xì)血管通透性有關(guān),敲除AQP1基因的小鼠肺泡毛細(xì)血管的水交換明顯減少,微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)水的通透性下降了10%。3.2關(guān)于apq1蛋白表達(dá)與aqp1免疫本研究免疫組化染色結(jié)果顯示,AQP1蛋白主要于非典型增生的上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的膜上以及正常宮頸組織毛細(xì)血管及小血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá),提示AQP1蛋白表達(dá)與正常宮頸、非典型增生宮頸組織和宮頸癌血管的水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。由于宮頸癌細(xì)胞和部分非典型增生的上皮細(xì)胞膜上表達(dá)AQP1蛋白,表明它除了在血管的水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起作用外,在維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡方面起著重要作用。研究表明,缺乏APQ1蛋白表達(dá)的小鼠,肺癌細(xì)胞平均生長時(shí)間降低50%,腫瘤部位缺乏血管。還有研究發(fā)現(xiàn),降低AQP1表達(dá),腫瘤血管增殖受損,導(dǎo)致腫瘤壞死。因此認(rèn)為,APQ1蛋白表達(dá)可能與腫瘤生長和血管形成有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),AQP1蛋白在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌中都有不同程度的表達(dá),陽性率分別為4.0%,33.3%和74.2%,表明AQP1蛋白在宮頸癌發(fā)展過程中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸升高的進(jìn)行性變化趨勢(shì),而且宮頸癌組織病理級(jí)別越高AQP1蛋白表達(dá)越強(qiáng),提示AQP1蛋白表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生及惡性程度相關(guān)。但是,AQP1蛋白表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無相關(guān),表明宮頸癌起源時(shí)就具有是否轉(zhuǎn)移的性質(zhì),并在發(fā)生發(fā)展中