酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅對早期斷奶犢牛生長性能及胃腸道發(fā)育的影響

酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅對早期斷奶犢牛生長性能及胃腸道發(fā)育的影響

胃不僅是動物消化和吸收食物的主要場所，也是身體的第一個防御屏障。定植于動物胃腸道中的良好的微生物菌群對腸道的組織形態(tài)、代謝和功能有極大的影響,有助于更大程度地發(fā)揮動物的生長性能。新生犢牛由于胃腸道消化機能及免疫屏障功能發(fā)育不健全,極易受病原微生物的侵害而引起腹瀉,導致高發(fā)病率和高死亡率。飼用抗生素(antibiotics)通過非選擇性抑菌或殺菌作用,可消除腸道有害微生物對犢牛生長的抑制作用。但是近年來,鑒于抗生素的大量使用導致了腸道菌群失衡等負效應,各國對抗生素的使用管理也越來越嚴格。因此,益生素(probiotics)的研究和應用逐步成為研究熱點之一。研究表明,在5周齡內犢牛的代乳粉中添加抗生素和益生素對于降低犢牛腹瀉和提高生長性能具有相似的效果。研究進一步證實,益生素可抑制由溶血性大腸桿菌導致的幼齡反芻動物腹瀉,進而促進幼齡反芻動物的生長。酵母β-葡聚糖不同于植物細胞壁中的β-(1→4)葡聚糖,酵母β-葡聚糖主要來源于酵母細胞壁,是由D-葡聚糖通過β-(1→3)鍵的方式相結合,并含有高度分支的β-(1→6)鍵結合的多聚糖。它在消化道中不可溶,不吸收,同時不產生黏性。目前,關于酵母β-葡聚糖在幼齡反芻動物中應用的研究報道較少,特別是關于它對犢牛腸道微生物區(qū)系影響的報道就更為少見。本試驗擬從早期斷奶犢牛生長性能、腸道主要微生物數(shù)量及胃腸道組織發(fā)育3方面來比較酵母β-葡聚糖與抗生素對早期斷奶犢牛腸道發(fā)育的影響,以期為早期斷奶犢牛胃腸道發(fā)育調控提供理論依據。1材料和方法1.1桿菌肽鋅的合成酵母β-葡聚糖為淡黃色粉末,購自珠海天添生物工程技術有限公司(批號20080701),干物質含量95.58%,粗蛋白質含量4.57%,純度為82.75%。桿菌肽鋅為淡褐色粉末,購自天津新星獸藥廠,含量15%。大腸桿菌購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,菌株號cvcc222,血清型O141∶K99,是引起犢牛腹瀉的主要治病菌。1.2試驗內容和方案試驗在中國農業(yè)科學院南口中試基地進行。選取20頭新生健康荷斯坦公犢牛(購自三元奶牛場),按體重和出生時間一致原則隨機分成4組,每組5個重復,每個重復1頭牛。犢牛1~7日齡飼喂鮮乳,飼喂量為犢牛體重的8%。飼養(yǎng)試驗于犢牛1周齡時進行,全期共28d。試驗基礎飼糧包括犢牛代乳粉和開食料2部分。整個試驗期內每天分別于08:00和18:00飼喂犢牛代乳粉飼糧(用煮沸后冷卻至40~45℃的熱水與代乳粉干物質按7∶1的重量比沖泡),乳液飼喂量為犢牛體重的10%。于犢牛第21日齡起開始訓練犢牛采食開食料飼糧,各組犢牛開食料的飼喂采用限飼制度,每頭犢牛每天補飼300g,自由飲水,記錄每天采食量。每頭犢牛單獨飼養(yǎng)于0.9m×3.5m的犢牛圍欄,下鋪設漏縫地板。試驗用代乳粉為中國農業(yè)科學院飼料研究所家畜營養(yǎng)與飼料研究室研發(fā)的產品,開食料組成及營養(yǎng)水平與代乳粉營養(yǎng)水平見表1和表2。每千克開食料含Onekgofstarterdietcontains:Fe9mg,Cu12.5mg,Mn130mg,Zn100mg,Se0.3mg,I1.5mg,Co0.5mg,VA15000IU,VD35000IU,VE50mg。1.3驗組的材料試驗采用單因素試驗設計,A組為對照組,B、C、D組為試驗組,具體見表3。在試驗第21天晨飼時,通過將大腸桿菌肉湯培養(yǎng)基(109個/mL)混入犢牛代乳品中對A、B、D3組進行口服大腸桿菌攻毒,攻毒劑量約為30mL。1.4樣品采集、測量設計和方法1.4.1體重和耗料量在試驗開始第1、14、21、28天晨飼前,稱取每頭犢牛的空腹體重。每日記錄犢牛代乳粉和開食料的耗料量。統(tǒng)計各階段犢牛的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和飼料轉化率(F/G)。1.4.2腸道內容物的制備于試驗第21天分別采集攻毒后3、12、24h犢牛直腸內約10cm處靠近上壺腹黏膜部的糞便樣品,無菌操作,迅速帶回實驗室,放入帶有玻璃珠的三角瓶中,稱重后以1∶9(W/W)的比例加入無菌生理鹽水,依次以10倍梯度稀釋,選擇適宜的稀釋度,分別涂布在乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(MRS)、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(均購于北京陸橋技術有限責任公司),每個梯度做3組重復,于37℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)72、24h后計算菌落數(shù),并以用1g腸道內容物中細菌個數(shù)的對數(shù)[lg(cfu/g)]表示直腸內容物中主要微生物數(shù)量。1.4.3組織切片及形態(tài)測量試驗第28天晨飼前從各組隨機選取3頭犢牛,用4%戊巴比妥鈉溶液(40mg/kgBW)將犢牛完全麻醉后,剖開腹腔分別在前背盲囊部分用利剪連續(xù)取下1cm2的組織塊,另取十二指腸近端5cm處、空腸中段和回腸中段約1cm的腸管,用生理鹽水沖洗殘余內容物后,迅速將樣品浸泡至入4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中固定,4℃固定48h后,石蠟包埋做組織切片。瘤胃及腸道固定樣品經蘇木精-伊紅(HE)染色后,在10×10倍光鏡(MoticBA200)下觀測其形態(tài)結構的變化,并利用Moticimagesadvanced3.2軟件測量瘤胃前背盲囊乳頭高度、乳頭寬度及黏膜厚度,小腸各部位絨毛高度、隱窩深度及黏膜厚度。每個樣本觀察2個非連續(xù)切片,每張切片選取3個視野,每個視野分別測定10組數(shù)據,其平均值作為1個測定數(shù)據。1.5平衡實驗設計方差分析試驗數(shù)據的統(tǒng)計與分析利用SAS8.2軟件包中的平衡實驗設計方差分析過程(ANOVA)進行,均值的多重比較采用Duncan氏法進行,以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。結果以平均值±標準差來表示。2結果2.1對adg和f/g的影響由表4可見,大腸桿菌攻毒前,即第1~14天和第14~21天2個階段時,與對照組相比,B組犢牛ADG分別提高了26.17%和24.93%(P<0.05),D組犢牛ADG分別提高了30.89%和28.57%(P<0.05);大腸桿菌攻毒后,即第22~28天期間,B、D組ADG分別比對照組提高了30.38%和30.81%(P<0.05),但與C組差異不顯著(P>0.05)。對于試驗各期F/G,B、D組均顯著低于對照組,特別是大腸桿菌攻毒后,B、D組F/G比對照組分別降低了15.74%和20.81%(P<0.05),與C組差異不顯著(P>0.05)。同樣的,從試驗全期來看,B、D組F/G比對照組分別降低了17.53%和19.58%(P<0.05)。2.2各組大鼠攻毒后乳酸官情況比較由表5可見,大腸桿菌攻毒后3、12和24h,B組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量高于對照組,但是差異不顯著(P>0.05),D組3個時間點乳酸桿菌數(shù)量均顯著低于B、C和對照組(P<0.05);而B、C組之間犢牛直腸乳酸桿菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。C組犢牛直腸中乳酸桿菌數(shù)量顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比,大腸桿菌攻毒后12h,B、D組顯著降低了犢牛大腸桿菌攻毒后12和24h時直腸中大腸桿菌數(shù)量(P<0.05),分別降低了9.79%、10.09%與16.35%、15.38%。同時,B組在12和24h時犢牛直腸大腸桿菌數(shù)量顯著高于C組(P<0.05)。同行數(shù)據肩標不同小寫字母者差異顯著(P<0.05),下表同。Inthesamerow,valueswithdifferentsmalllettersuperscriptsmeansignificantdifference(P<0.05),thesameasbelow.2.3各組大鼠陰血壓v/c組,c組與b組含量比較由表6可見,與對照組相比,B、C組可顯著增加犢牛瘤胃乳頭高度、寬度(P<0.05)。與對照組相比,各組犢牛十二指腸絨毛高度無顯著差異(P>0.05),而C、D組犢牛十二指腸隱窩深度顯著低于對照組和B組(P<0.05);B、C和D組絨毛高度和隱窩深度比(V/C)顯著高于對照組(P<0.05)。各組犢?？漳c中段絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05),絨毛高度和隱窩深度比(V/C)也以試驗B、C組顯著高于對照組(P<0.05)?；啬c中段各形態(tài)指標與空腸中段變化趨勢相同,各組間絨毛高度和隱窩深度無顯著差異(P>0.05),但B、C和D組V/C顯著高于對照組(P<0.05)。3討論3.1-葡聚糖對幼齡動物生長性能的影響桿菌肽鋅是多肽類抗生素,一方面它可以抑制腸內病原性微生物的增殖,促進有益微生物的生長,減少發(fā)病率,從而促進動物生長;另一方面,桿菌肽鋅可使畜禽腸壁變薄,增加腸黏膜的通透性和改變腸內代謝環(huán)境,從而促進營養(yǎng)的消化吸收。研究表明,在火雞飼糧中添加桿菌肽鋅20、50和100mg/kg,飼料轉化率分別提高了0.4%、1.1%和1.5%,增重分別提高了1.6%、2.3%和2.8%。據報道,在仔豬飼料中添加桿菌肽鋅50mg/kg,增重比添加土霉素組提高了22.4%,飼料轉化率提高了14.5%,并證明桿菌肽鋅與硫酸抗敵素合用,可明顯提高仔豬的增重、飼料報酬及具有良好的預防腹瀉效果。目前,關于β-葡聚糖對幼齡動物生長性能的影響的報道較多,β-葡聚糖與其他免疫增強劑(如脂多糖)不同,它對動物的食欲、生長沒有不良影響,并且在飼料中添加β-葡聚糖可以促進動物生長。在19日齡斷奶仔豬的試驗中發(fā)現(xiàn),在飼料中添加0.05%~0.80%的β-葡聚糖可顯著改善仔豬斷奶第14天后的生長性能,所有β-葡聚糖添加組仔豬的飼料轉化率均顯著高于對照組(P<0.05)。而另一些研究認為β-葡聚糖提高仔豬的生長速度是由于提高了日采食量,對ADG和F/G無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌攻毒前,與對照組相比,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅均可顯著提高犢牛ADG;同樣,試驗各期F/G,添加酵母β-葡聚糖(B組)和桿菌肽鋅(D組)均顯著低于對照組,而試驗各期各組犢牛ADFI均無顯著差異。就本試驗來看,在正常的飼養(yǎng)模式下,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅對于提高犢牛生長性能具有相似的效果。本試驗中大腸桿菌攻毒后,B、D組ADG顯著高于對照組,但是與未攻毒組(C組)差異不顯著。同樣的,B、D組F/G顯著低于對照組,但與未攻毒組差異不顯著(P>0.05)。因此,在本試驗攻毒應激模式下,酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅可能會減輕大腸桿菌對犢牛的損傷,并且與未攻毒組差異不顯著。對于酵母β-葡聚糖組來說,試驗結果可能是由于在感染前使用β-葡聚糖可增強機體的免疫清除作用,將抗原抗體反應控制在膜免疫局部,減少了全身免疫的負擔,并且這種免疫保護作用是以非炎癥的方式來進行的,即對動物的生長沒有不良影響。3.2酵母-葡聚糖和桿菌肽鋅的制備對患者腸道增殖的影響研究證實,大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸桿菌的生理功能與動物機體的生命活動息息相關。本試驗在抑制直腸中大腸桿菌增殖上,酵母β-葡聚糖的抑菌效果略低于桿菌肽鋅。這可能是由于酵母β-葡聚糖和桿菌肽鋅在抑制大腸桿菌增殖上的方式不同,桿菌肽鋅對革蘭氏陽性細菌有強烈的抗菌作用,對部分革蘭氏陰性菌、放線菌、螺旋菌體抑制效果也明顯,其機制主要為抑制細菌的細菌壁合成,也能與敏感細菌的細胞膜結合,損傷細胞膜的完整性,導致細胞內重要物質外流,從而阻礙腸道內細菌繁殖。而β-葡聚糖主要是在結腸微生物的作用下生成短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸能促進腸黏膜的生長。另一方面,β-葡聚糖可通過增加腸道分泌型免疫球蛋白(IgA)的分泌量而減少致病微生物對腸道的黏附,從而減少大腸桿菌增殖。3.3小鼠腸道功能特性與腸道感染的關系眾所周知,瘤胃功能的建立是瘤胃內容物經發(fā)酵產生的揮發(fā)性脂肪酸刺激的結果。Lesmeister等通過統(tǒng)計學分析對試驗所需犢牛數(shù)量、樣品采集部位、樣品采集數(shù)量等進行討論,認為在評定瘤胃的指標中,瘤胃乳頭的長度是最重要因素,其次是瘤胃乳頭的寬度和黏膜厚度。本試驗結果顯示,瘤胃乳頭長度、寬度和黏膜厚度隨飼糧中酵母β-葡聚糖含量的增加而增大,其中酵母β-葡聚糖組顯著高于其余各組,這與前述結果相一致,其原因可能是β-葡聚糖增加了總揮發(fā)性脂肪酸的產量,從而刺激瘤胃乳頭發(fā)育有關。小腸的正常結構是營養(yǎng)物質被充分消化與吸收的基本保證。特別是小腸的絨毛長度、V/C、黏膜厚度及絨毛表面積是衡量小腸消化吸收功能的重要指標。腸絨毛高度與細胞數(shù)量呈顯著相關。絨毛高,則成熟的上皮吸收細胞多,對腸道營養(yǎng)物質的吸收能力就強,隱窩深度反映了細胞生成率,隱窩基部向絨毛端部遷移、分化,形成具有吸收能力的絨毛細胞,以補充絨毛上皮的正常脫落,基部的細胞生成率降低,使隱窩變淺。V/C綜合反映小腸的功能狀況。比值上升,則黏膜改善,消化吸收功能增強;比值下降,消化吸收功能降低,動物生長發(fā)育受阻。陳代文等研究表明斷奶仔豬飼糧由母乳轉變?yōu)榇槠窌r如果飼養(yǎng)管理不善,極易加劇腸道對飼糧的過敏反應,仔豬小腸表現(xiàn)為嚴重絨毛脫落、腸黏膜細胞增生和隱窩細胞有絲分裂速度加快,進而導致了仔豬腹瀉。而張運濤等研究表明酵母多糖對小腸黏膜的具有保護作用,掃描電鏡觀察表明,對照組小腸絨毛變形、微絨毛脫落,而