青貯飼料用l型乳酸菌菌種的分離與培養(yǎng)條件

青貯飼料用l型乳酸菌菌種的分離與培養(yǎng)條件

蘑菇添加劑在促進山羊生長、提高山羊健康以及改善綠色飼料的質(zhì)量方面發(fā)揮著很好的作用。為此,我們結(jié)合青貯飼料生產(chǎn)實際,采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)等方法,培養(yǎng)、分離、篩選了L型乳酸菌菌種,并確定其適宜的培養(yǎng)條件,為青貯飼料乳酸桿菌制劑的生產(chǎn)和應用提供了參考。1材料和方法1.1液體培養(yǎng)不加采用西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基,即西紅柿汁400mL、葡萄糖10g、酵母10g、鹽溶液1號5mL、鹽溶液2號5mL、蒸餾水600mL、瓊脂15g(液體培養(yǎng)不加),pH6。1.2初篩和復篩分離為出發(fā)菌株采樣→增殖培養(yǎng)→平板分離→第二次增殖培養(yǎng)→第二次平板分離→第三次增殖培養(yǎng)→第三次平板分離→初篩(定性和半定量測定)→復篩→再復篩→平板分離→得出較優(yōu)菌株(每樣1~3株)→進一步做生產(chǎn)性能試驗或作為育種的出發(fā)菌株,必要時還需做毒性試驗等。1.2.1樣品的采集以生產(chǎn)青貯飼料乳酸菌添加劑為目的,通過綜合分析和篩選比較確定從發(fā)酵植物中進行采樣,主要采集泡菜、漿水、酸菜、青貯飼料當中的乳酸菌樣品。1.2.2乳酸菌增殖培養(yǎng)開始采集的樣品中一般都雜居著多種微生物。為了培養(yǎng)分離出生產(chǎn)所需的專用乳酸菌,首先需進行增殖培養(yǎng),以擴大微生物數(shù)量,增加分離機率。增殖培養(yǎng)采用液體培養(yǎng),共進行3次,且培養(yǎng)一次、分離一次。1.2.3乳酸菌分離培養(yǎng)通過增殖培養(yǎng)仍達不到純化目的,仍有其他雜菌與之共存,為了取得所需的乳酸菌純種,需進一步進行分離培養(yǎng)。根據(jù)實驗室條件,采用固體培養(yǎng)平板劃線法進行分離培養(yǎng)。同時為了提高分離純度,對培養(yǎng)基及環(huán)境條件做了進一步的研究控制。1.2.4培養(yǎng)基的制備為了提高篩選效率,除增殖培養(yǎng)時應控制增殖條件外,在純種分離時,培養(yǎng)條件對篩選結(jié)果影響很大,更需要注意。具體分述如下:1.2.4.1控制營養(yǎng)成分培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分主要指氮、碳、維生素及無機鹽等。根據(jù)乳酸菌的發(fā)酵原理,采用蛋白胨、酵母膏、葡萄糖為主要營養(yǎng)來源的培養(yǎng)物。1.2.4.2控制培養(yǎng)基的酸堿度各種微生物生長繁殖所適宜的酸堿度不同,乳酸菌所需最適pH在6~6.5之間。1.2.4.3添加抑制劑采用能促進乳酸菌生長,而抑制其他菌生長的碳酸鈣、西紅柿汁及醋酸鹽做抑制劑。1.2.4.4控制培養(yǎng)溫度青貯飼料用乳酸菌多屬低溫發(fā)酵菌,培養(yǎng)溫度以28~32℃為適宜。1.2.4.5控制通氣條件乳酸菌為厭氧菌,需在厭氧條件下培養(yǎng)。根據(jù)本課題實驗條件,采用化學法吸收氧氣,即利用焦性沒食子酸與氫氧化鈉反應,將氧吸去。1.2.5菌種篩選結(jié)果培養(yǎng)分離后,每個樣品獲得兩株較優(yōu)的菌株。為了使乳酸菌有互補作用,將已獲得的4個樣品的菌樣按1∶1的比例進行混合,共制成6個混合菌液,從中篩選獲得菌株10株。1.2.6植物的馴化誘導經(jīng)過培養(yǎng)、分離、篩選的菌株稱為野性菌株,必須進行人工育種,得到變異菌株。采用馴化與誘變的方法進行培育。1.2.6.1.飼養(yǎng)將篩選出的菌種分別接種于20%、40%的苜蓿浸汁培養(yǎng)基中,進行培養(yǎng)馴化。1.2.6.2.紫外誘導將乳酸菌懸浮液5mL置于凈化臺中,進行紫外線光源照射,每次15min,誘變時攪拌均勻,使菌懸浮于懸浮液中。1.3發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)方法采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩種。1.3.1菌種的制備和接種按培養(yǎng)基的配方稱取各種原料,加入蒸餾水使之溶解,再加入西紅柿汁與醋酸鹽類抑制劑,調(diào)節(jié)pH為6~6.5,進行高壓滅菌30min,取出置入無菌操作臺中自然冷卻,再倒入試管中約5~10mL進行接種。接種采用接種環(huán)刮取少許的菌絲,伸入盛有培養(yǎng)基試管中輕輕攪動,使菌絲完全溶解于液體培養(yǎng)基中?；蛘哂梦芪【鷳乙?.5mL注入液體培養(yǎng)基中,輕輕搖勻。用棉塞塞緊試管口,放入恒溫箱中在32~33℃的溫度培養(yǎng)發(fā)酵48h。1.3.2固體培養(yǎng)基的制備采用平板劃線法。首先按培養(yǎng)基的配方稱取原料,加入蒸餾水溶解,再加入西紅柿汁與醋酸鹽類抑制劑,調(diào)節(jié)pH為6.5后加入瓊脂,進行高壓滅菌30min,取出置入無菌操作臺中,冷卻后倒入平皿或試管中(倒入試管后傾斜放置),自然冷卻至凝固后接種。將接種環(huán)伸入菌懸液中,取出后在平皿或試管斜面固體培養(yǎng)基上來回輕輕的劃線。劃線完畢后進行排氧封固培養(yǎng)。試管斜面培養(yǎng)采用大試管套小試管的方法。稱取1g的焦性沒食子酸倒入大試管中,再放入數(shù)粒小玻璃珠,將接種后的小試管放入大試管中,吸10%NaOH沿大試管邊注入大試管底部,迅速用橡皮塞把大試管口塞緊。放入恒溫箱于32~33℃溫度培養(yǎng)發(fā)酵76h。平面皿固體培養(yǎng)采用凡士林與石臘封固平面皿周圍的方法。稱凡士林與固體石臘各一半混合放入鐵器中置酒精燈上加熱融化成液體狀備用。稱取1g焦性沒食子酸,用兩層細紗布包住放在倒置的平面皿蓋上,將接好種的平面皿底倒置扣于平面皿蓋上,注意使焦性沒食子酸與接好種的固體培養(yǎng)基不要接觸,然后吸1mL10%NaOH,揭起平面皿滴入包焦性沒食子酸紗布上,迅速蓋住后用注射器吸取融化好的液體石臘,均勻地注射涂于平面皿邊縫處封固,使內(nèi)外空氣完全隔絕,放入恒溫箱于32~33℃溫度培養(yǎng)發(fā)酵76h。1.4性能試驗1.4.1視野觀察的基礎采用直接計數(shù)法(全數(shù)法)。每個菌株取1mL菌液,加9mL生理鹽水混勻后從中再取1mL,再加生理鹽水9mL進行二次稀釋,然后置于載玻片上,在顯微鏡下觀察,載玻片面積1cm2,每次平均觀察20~30個視野后代入公式計算。即:每mL原菌液含菌數(shù)=視野中的平均數(shù)1cm2/視野面積×100×稀釋的倍數(shù)。1.4.2蘑菇的形狀采用革蘭氏染色法。1.4.3ph值采用精密pH試紙測定。1.4.4測定細菌數(shù)量活菌數(shù)和細菌總數(shù)的測定。1.4.5綠色飼料試驗采用小塑料袋袋裝試驗。以青玉米和苜蓿為原料,液體乳酸菌為添加劑,按1000:4的比例添加。2菌株生長特性采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的方法,經(jīng)過幾次增殖培養(yǎng)和分離培養(yǎng)后,又進行初篩和復篩共獲得48株菌株(1瓶1株)。通過鑒定屬真細菌目乳桿菌科,為L型乳酸桿菌。每株經(jīng)過涂片染色,在顯微鏡下觀察,細胞形態(tài)呈桿狀,大小為3.0~8.0×0.7×1.0μm,單個或呈短鏈,不運動,革蘭氏陽性。培養(yǎng)特征為,瓊脂斜面生長稀薄;肉汁培養(yǎng)混濁,有絮狀物,石蕊心牛奶凝固;瓊脂平板培養(yǎng)生長菌落小,白色、扁平、圓鋸齒形(光學顯微鏡照片)。通過直接計數(shù)法對菌種生長量測定,每個菌株含菌數(shù)都符合要求。即:1號樣菌液每mL含菌數(shù)為5×106;2號樣菌液每mL含菌數(shù)為6×106;3號樣菌液每mL含菌數(shù)為10×107;4號樣菌液每mL含菌數(shù)為10×106;5號樣菌液每mL含菌數(shù)為8×106。達到了原設計活菌數(shù)的要求。在實驗室進行小袋袋裝青貯試驗,其結(jié)果不論氣味、色澤、質(zhì)地均優(yōu)于對照組。其中以3、4、