實時熒光定量pcr法檢測宮頸疾病血清中mir-21的表達

實時熒光定量pcr法檢測宮頸疾病血清中mir-21的表達

mirna是一個非編碼的小分子rna，由內(nèi)源性非編碼物質(zhì)組成，長度約為21.25g鈉，5'帶磷酸基團和3'帶羥基的非編碼調(diào)節(jié)家族組成。其通過與mRNAs結(jié)合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起到基因調(diào)控的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA類型約700種以上,通過實驗驗證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫和軟件推測其中人源的miRNA約有200多種。miRNA對疾病的影響、致病機制已成為研究的熱點。通過miRNA芯片分析發(fā)現(xiàn),miR-21在乳腺癌、肺癌、食管癌、胰腺癌等組織中表達水平較高。miR-21位于HPV-16整合位點之一,即脆性位點FRA17B區(qū)域中。在99.7%宮頸鱗癌和94%~100%的宮頸腺癌及腺鱗癌中都檢測到高危型HPV感染,其中HPV-16是最常見的類型。因此,是否能將miR-21作為一個新標(biāo)志物,通過檢測血清中miR-21的表達水平來進行宮頸癌的早期診斷和預(yù)后判斷,是本研究的主要目的。1材料和方法1.1病例選擇選擇暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科擇期手術(shù)的10例宮頸癌患者,年齡34~66歲,平均年齡43歲,病理檢查結(jié)果為低分化鱗狀細胞癌,淺層浸潤;10例子宮肌瘤患者,年齡32~56歲,平均年齡40歲,病理檢查結(jié)果為子宮平滑肌瘤;10例宮頸炎患者,年齡25~55歲,平均年齡37歲,病理檢查宮頸呈慢性炎癥;2位宮頸鱗癌患者術(shù)后,年齡為47歲和48歲。上述研究對象均取外周靜脈血3mL,分離血清,置-70℃保存。1.2pcr試驗方法Trizol試劑(美國Invitrogen公司);氯仿、無水乙醇、異丙醇和DEPC水(廣州達暉公司);miR-21熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪公司);逆轉(zhuǎn)錄所需的dNTPs及逆轉(zhuǎn)錄酶、100bpDNALadderMarker(廣州達暉公司);ABIPrismue4f07000熒光定量PCR儀(美國ABI公司);KDC-160HR高速冷凍離心機(中國科技大學(xué)中佳公司);ESCO生物安全柜(ESCO公司);Biophotometer生物分光光度計(Eppendorf公司)。1.3-4-gcctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagct-5-aecgctacgaatttgrt-35555555555555555555555555555-gcctagctagctagctagctagctagctacrtgactctacrtgactagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctacrt-3555555555555555555555555-ctacrtcactacrtcactagctagctagctagctagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctacrtcactagctagctagctagctagctagctacrta,5-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-35-CACTGGATACGACTCAACA-3′,PCR擴增引物上游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;下游:5′-GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT-3′。內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;PCR擴增引物上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以上引物均由上海吉碼公司合成。1.4hp-key檢測取患者宮頸脫落細胞用導(dǎo)流雜交法(凱普公司人乳頭瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒)檢測感染HPV基因型。1.5樣品國的制備吸取250μL患者血清,加入1mLTrizol試劑,反復(fù)吹打裂解細胞,室溫靜置5~30min。12000×g離心10min,取上清,加入200μL氯仿/mL。劇烈震蕩15s至乳膠狀,室溫靜置15min。12000×g,4℃離心10min。另取1個EP管加入500μL異丙醇,將上層水相加入混合均勻,室溫靜置10min。12000×g,4℃離心10min。棄上清,用0.1%DEPC水配制的75%乙醇混勻。7500×g,4℃離心15min。盡量去除上清液,RNA沉淀空氣干燥10~30min,加入20~30μLDEPC水溶解RNA,65℃烤箱10~15min。在260nm和280nm波長下檢測吸光度(A)比值,確定RNA的純度及濃度。1.6逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測n-msv反應(yīng)體系為20μL,包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL,dNTP(10mmol/L)0.75μL,miR-21逆轉(zhuǎn)錄引物(1μmol/L)1.20μL,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)0.2μL,總RNA樣本5μL,DEPC水8.85μL。反應(yīng)設(shè)1個復(fù)孔。反應(yīng)條件為16℃30min,42℃30min,85℃5min。內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)同上。1.7財聚酶抑制劑taqnat反應(yīng)體系為20μL,包括2×realtimePCR緩沖液10μL(含SYBRGreenI熒光染料),上、下游引物(5μmol/L)各0.16μL,cDNA模板2μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL,DEPC水7.48μL。以同樣反應(yīng)體系和U6特異性引物進行內(nèi)參U6熒光定量。反應(yīng)參數(shù):95℃3min;95℃12s、62℃50s,共40個循環(huán)。陰性對照以生理鹽水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴增和引物二聚體的出現(xiàn)。以所有標(biāo)本中miR-21基因Ct值最低的標(biāo)本作為對照,△Ct=CtmiR-21-CtU6snRNA,△△Ct=△Ct實驗標(biāo)本-△Ct對照標(biāo)本,miR-21基因相對表達量用2-△△Ct計算。1.8各組患者的表達水平比較用SPSS17.0軟件進行。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)miR-21基因相對表達量不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件,故以M(P25,P75)表示,用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1篩查基因型確定10例宮頸鱗癌患者宮頸刮取物標(biāo)本HPV篩查基因型為HPV-16型陽性;10例子宮肌瘤患者、10例宮頸炎患者以及2例宮頸原位癌術(shù)后患者HPV基因型檢查均為陰性。2.2ir-21熔解溫度miR-21、U6的熔解曲線峰值單一,略有差異,未見雜峰信號;miR-21熔解溫度為81℃,U6熔解溫度為83℃。表明PCR參數(shù)選擇適當(dāng),miR-21、U6逆轉(zhuǎn)錄引物和擴增引物能夠擴增出miR-21、U6片段,產(chǎn)物特異度較好,非特異產(chǎn)物對結(jié)果影響較小。2.3mir-21、u6snna檢測陰性對照產(chǎn)生的微弱的非特異擴增信號明顯滯后于患者血清標(biāo)本的曲線。患者血清miR-21反應(yīng)曲線呈標(biāo)準S型。32份血清樣本中的miR-21、U6snRNA檢測結(jié)果見表1。宮頸癌患者血清中miR-21表達水平明顯高于子宮肌瘤(Z=3.781,P<0.05)和宮頸炎患者(Z=3.780,P<0.05)。子宮肌瘤和宮頸炎患者血清中miR-21表達水平無顯著差別(Z=0.983,P>0.05)。宮頸癌患者術(shù)后血清miR-21表達水平低于宮頸癌術(shù)前,但標(biāo)本量較少無法做統(tǒng)計學(xué)分析。3mir-21在臨床研究中的應(yīng)用miRNA分子的序列短小,在基因組中存在較多的互補序列,在不同生物體內(nèi)與靶標(biāo)結(jié)合的方式也不盡相同,而且還常與多種蛋白質(zhì)相互作用,因此建立一種有效而且普遍適用的研究方法異常困難。目前常用的檢測miRNA的方法有基因芯片、TaqMan探針法、northernblot等。芯片具有高通量性可一次檢測多種miRNA,但不穩(wěn)定,經(jīng)過芯片篩選出來的miRNA往往需要進一步驗證。TaqMan探針法具有特異性高,花費時間短等優(yōu)點,但成本較高。northernblot是驗證和確認miRNA的經(jīng)典方法,但該法繁瑣并且靈敏度低,不適于臨床大規(guī)模篩查。本研究用價廉的SYBRGreenI熒光定量PCR法檢測宮頸癌患者血清miR-21的表達水平,屬國內(nèi)首報。本實驗用SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR法檢測宮頸癌患者血清中的miRNA,設(shè)計具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進行實時熒光定量PCR。通過熔解曲線的分析結(jié)果可以看出基本沒有引物二聚體的形成,證明了反應(yīng)的特異性。分析熒光定量的結(jié)果發(fā)現(xiàn),宮頸癌患者血清中miR-21水平明顯高于子宮肌瘤、宮頸炎等