應(yīng)用rapd技術(shù)構(gòu)建與抗性相關(guān)的抗根結(jié)線蟲病基因連鎖的scar標(biāo)記

應(yīng)用rapd技術(shù)構(gòu)建與抗性相關(guān)的抗根結(jié)線蟲病基因連鎖的scar標(biāo)記

根結(jié)線蟲是番茄的一個(gè)重要疾病之一。隨著非點(diǎn)源植物面積的增加，尤其是日光溫室的大面積推廣，根結(jié)線蟲的危害日益嚴(yán)重。目前，生產(chǎn)根結(jié)線蟲的栽培方法很多，但抗病性效果并不理想，不能從根本上解決問題?？共∑贩N的創(chuàng)造是經(jīng)濟(jì)有效的方法。番茄抗根結(jié)線蟲育種研究始于19世紀(jì)30年代,1940年Bailey篩選出11份抗根結(jié)線蟲的材料,1956年Gibert指出對(duì)根結(jié)線蟲的抗性基因是由一個(gè)顯性基因Mi控制。以后人們又相繼研究了Mi基因,并發(fā)現(xiàn)Mi基因是所有番茄栽培種的惟一抗原。該基因可抗除北方根結(jié)線蟲以外的其余3種主要線蟲。目前克隆Mi基因技術(shù)亦趨成熟,Messeguer等(1991)構(gòu)建了Mi基因側(cè)翼的9個(gè)高分辨率RFLP圖譜。Aarts(1991)研究出與Mi緊密連鎖的酸性磷酸酶-1(APS-1)座位的一個(gè)探針。Kaloshian等和Milligan等用定位克隆的方法從野生番茄(Lycoperisiconperuvianum)中分離到Mi基因。另外,隨著轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)展,可利用轉(zhuǎn)入人工抗線蟲基因使番茄獲得對(duì)根結(jié)線蟲抗性成為可能。目前,在植物抗病育種中,分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為育種工作提供了有力的輔助工具,利用緊密連鎖的分子標(biāo)記可以在任意發(fā)育階段對(duì)品種的抗性進(jìn)行鑒定。RAPD標(biāo)記是目前最常用的分子標(biāo)記之一,但其可靠性、穩(wěn)定性較差。根據(jù)RAPD標(biāo)記兩端序列,設(shè)計(jì)18～25堿基的引物,通過PCR特異擴(kuò)增,可以將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR(Sequencecharacterizedamplifiedregion)標(biāo)記,SCAR標(biāo)記特異性和重復(fù)性較好,操作簡(jiǎn)單、快捷,在分子標(biāo)記輔助育種中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技術(shù),篩選到一個(gè)與番茄抗根結(jié)線蟲病基因連鎖的RAPD標(biāo)記,并將該標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)化成了SCAR標(biāo)記,為應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種及為進(jìn)一步克隆該抗病基因打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1波斯材料抗病親本04957、感病親本T431以及04957和T431有性雜交的F2代單株。上述材料均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系番茄課題組提供。1.1.2病毒病原線蟲為南方根結(jié)線蟲(Meloi-dogyneincognita),由本課題組提供。1.2方法1.2.1抗感親染對(duì)fpss2代群體的致病性調(diào)查用水培繁殖方法大量繁殖蟲態(tài)一致的二齡幼蟲,接種于抗感親本及F2代群體各單株,到接種后50d,調(diào)查發(fā)病情況,將F2代群體分為抗病和感病兩級(jí)。具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.2.2羽毛dns的提取所有試材播種于溫室,待幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí),取新葉約100mg,采用改良的SDS法提取DNA。1.2.3dntps和taqcda聚合酶系統(tǒng)集成的構(gòu)建隨機(jī)引物篩選采用Michelmore的混合分組分析法(BSA)進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)液組成為10×PCRbuffer、2.5mmol/L的dNTPs、25mmol/L的MgCl2、1U的TaqDNA聚合酶、15ng/μL隨機(jī)引物,20～50ng模板DNA。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,36℃復(fù)性1min,72℃延伸1.5min,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。反應(yīng)在美國PE公司生產(chǎn)的PE-480型擴(kuò)增儀上進(jìn)行,擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%的瓊脂糖凝膠上電泳分離,溴化乙錠染色后,在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。1.2.4菌株鑒定及測(cè)序利用DNA快速回收試劑盒,從1.0%瓊脂糖凝膠中回收RAPD特異片段,純化后用pGEM-T-Easy載體連接,轉(zhuǎn)化于大腸桿菌(E.coli)DH5-α菌株上。測(cè)序由上海生工公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,利用DNAMEN軟件設(shè)計(jì)出1對(duì)SCAR標(biāo)記的特異引物,除將RAPD擴(kuò)增條件調(diào)整為上下游引物各1μL、59℃復(fù)性外,其它同RAPD分析,用該引物對(duì)親本及F2分離群體進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。2結(jié)果與分析2.1番茄抗根結(jié)線蟲病鑒定結(jié)果在感病親本T431充分發(fā)病的情況下,參照抗病親本04957的抗性表現(xiàn)對(duì)F2代群體的183個(gè)單株進(jìn)行了番茄抗根結(jié)線蟲病鑒定,其中抗病138株,感病45株,χ2測(cè)驗(yàn)符合單顯性基因的遺傳規(guī)律。2.2opd20/400對(duì)mi基因型別的復(fù)選篩選Operon公司的8組共160條隨機(jī)引物,對(duì)抗感親本進(jìn)行RAPD分析,經(jīng)3次重復(fù),有18條引物能夠在抗感親本間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,然后將這18條多態(tài)性引物到抗感池進(jìn)行復(fù)選以及進(jìn)行F2代單株驗(yàn)證,經(jīng)3次重復(fù),結(jié)果一致,得到1個(gè)特異引物OPD20,特異片段的分子量約為1500bp,將其命名OPD20/1500,可以初步確定OPD20/1500與Mi基因存在連鎖關(guān)系(圖1),用Mapmarker/3.0軟件對(duì)分離群體單株的抗病性和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析,利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳圖距[cM(centimorgan)],計(jì)算出OPD20/1500與抗病基因的連鎖距離為9.0cM(表1)。2.3pd20/400p的建立將該RAPD特異片段回收、克隆后,經(jīng)酶切鑒定,證明重組克隆所含的插入片段為所要的目的片段。在上海生工測(cè)序后得到該片段的全長(zhǎng)序列。結(jié)果表明:該片段OPD20/1500的實(shí)際大小為1454bp,并且將此序列提交到GenBank,登錄號(hào)為DQ090954。將獲得的該RAPD片段的全長(zhǎng)序列與其它基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),發(fā)現(xiàn)與已知的抗病基因(Mi)沒有同源性,而該序列中的部分堿基序列與水稻的微衛(wèi)星片段MRG6300的一段核苷酸序列有一定的同源性,同源性高達(dá)96%,用Generunner軟件初步分析其編碼的氨基酸結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)沒有完整的氨基酸序列,與番茄抗根結(jié)線蟲病基因Mi沒有聯(lián)系。2.4rapd反應(yīng)程序的優(yōu)化及驗(yàn)證根據(jù)RAPD標(biāo)記特異片段兩端的堿基序列和引物設(shè)計(jì)原則,利用DNAMEN軟件設(shè)計(jì)出了1對(duì)22和25個(gè)堿基的核苷酸引物。SenseprimerP1:5′-GGGTCGCTATGATAAGGATTCT-3′;Antisen-seprimerP2:5′-ACCCGGTCACCTTATTAATTAAATA-3′。為了確定這對(duì)引物的特異性,對(duì)供試植株進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,因此,本試驗(yàn)中共設(shè)計(jì)了6個(gè)退火溫度梯度,來達(dá)到優(yōu)化反應(yīng)程序的目的。最終確定59℃為反應(yīng)的最佳退火溫度,可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定擴(kuò)增,反應(yīng)的其它條件沒有改變。用設(shè)計(jì)的引物P1+P2在優(yōu)化好的59℃退火溫度下對(duì)抗感親本、抗感池及其F2代抗感單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,在抗病親本、抗病池及F2代抗病單株中均能穩(wěn)定擴(kuò)增出1條大小為1000bp左右的特異片段,而在感病親本、感病池及F2代感病單株中均無此差異片段的擴(kuò)增。分析結(jié)果和RAPD分析完全一致,而且穩(wěn)定性和重復(fù)性大大提高,此結(jié)果表明RAPD標(biāo)記OPD20/1454已被成功地轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記,暫將該SCAR標(biāo)記命名為SCD20/1000。圖2為獲得的SCAR標(biāo)記在抗感親本、抗感池及F2代單株中擴(kuò)增情況驗(yàn)證。3抗感基因池的構(gòu)建番茄抗根結(jié)線蟲基因Mi,可抗除北方根結(jié)線蟲以外的其余3種主要根結(jié)線蟲,Mi基因是所有番茄栽培種的惟一抗原。而本研究中所用抗病親本材料04957經(jīng)驗(yàn)證對(duì)南方根結(jié)線蟲表現(xiàn)高抗,含有Mi基因。目前侵染番茄的大多是南方根結(jié)線蟲,所以在進(jìn)行抗病性鑒定接種時(shí)也用南方根結(jié)線蟲作為接種源。本研究中所建立的分子標(biāo)記在理論上除可以驗(yàn)證對(duì)南方根結(jié)線蟲的抗性外,還可以驗(yàn)證除北方根結(jié)線蟲以外的其余2種主要根結(jié)線蟲的抗性,這些在實(shí)踐中有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究通過運(yùn)用RAPD技術(shù),采用混合分組分析法(BSA),獲得了1個(gè)與番茄抗根結(jié)線蟲病基因連鎖的RAPD標(biāo)記OPD20/1500,利用BSA法需要構(gòu)建抗感基因池,試驗(yàn)結(jié)果的可靠性依賴于抗病植株和感病植株的準(zhǔn)確鑒定,本試驗(yàn)中抗病性鑒定方法參照Yu等的方法進(jìn)行,本試驗(yàn)方法保證了抗病性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于RAPD標(biāo)記是用十個(gè)核苷酸的隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的,對(duì)反應(yīng)條件的變化很敏感,因此重復(fù)性較差,但如果嚴(yán)格控制反應(yīng)條件,采用同一公司同一批號(hào)的反應(yīng)試劑,同樣可以獲得重復(fù)性較好的結(jié)果。而SCAR標(biāo)記是另一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記,它通過1對(duì)特異引物來擴(kuò)增單個(gè)基因組序列,SCAR標(biāo)記與RAPD相比,其對(duì)反應(yīng)條件的敏感程度低,因此特異性和重復(fù)性較好,