植物細(xì)菌性青枯病與根結(jié)線蟲病的復(fù)合病害控制

植物細(xì)菌性青枯病與根結(jié)線蟲病的復(fù)合病害控制

植物細(xì)菌的綠色損害是由綠穗菌引起的毀滅性土傳病，通常發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)。這在中國南方的五個省份報(bào)告，危害嚴(yán)重。由于這類病害的寄主范圍廣,且其病原存在較大的變異,目前尚無有效的化學(xué)防治方法。近十幾年來,生物防治作為一種很有潛力的病害控制手段,在青枯病的生物控制上取得了一定的進(jìn)展,但大多研究僅針對青枯病原本身,極少考慮其他生物和環(huán)境因素的影響。青枯病病害系統(tǒng)相當(dāng)復(fù)雜,許多外界因素(如其他生物、土壤質(zhì)地等)對病害的發(fā)生、流行都有很大影響。普遍認(rèn)為,植物寄生線蟲能夠加重青枯病害的發(fā)病程度,近年的研究也發(fā)現(xiàn),根結(jié)線蟲不僅給青枯病的發(fā)生創(chuàng)造了更多的傷口,還與青枯菌協(xié)同作用,形成侵染性更強(qiáng)的復(fù)合性病害。廖月華等的研究表明,蔬菜青枯病的發(fā)生與土壤中根結(jié)線蟲量呈正相關(guān)。因此,在青枯病的防治實(shí)踐中,充分考慮根結(jié)線蟲這一重要因素,建立“主治青枯,兼防線蟲”的復(fù)合病害防治思路具有積極意義。本試驗(yàn)利用番茄根系的拮抗菌,分別以青枯病菌和根結(jié)線蟲為靶標(biāo),篩選能有效抑制兩種不同病原的拮抗菌株,并嘗試?yán)没钚跃隃p緩復(fù)合侵染病情,旨在為細(xì)菌性青枯病與根結(jié)線蟲的復(fù)合病害控制尋找一條有效途徑。1材料和方法1.1分離自番茄根EN系列菌株參照內(nèi)生細(xì)菌分離方法分離自受根結(jié)線蟲侵染的番茄根系;S系列菌株分離自番茄根表。青枯病菌菌株分離自病株莖部,并經(jīng)TTC平板和回接法測定其致病力。供試根結(jié)線蟲群體以南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)為主,于溫室中感病番茄繁殖。1.2波斯品種早豐(西安陽光種業(yè)有限公司)。1.3培養(yǎng)基NA培養(yǎng)基用于病原細(xì)菌分離和拮抗活性測定;PDA用于拮抗菌分離。1.4抑菌圈大小測定移取300μL番茄青枯病菌的NB培養(yǎng)物至滅菌的NA平板上,均勻涂布后風(fēng)干,將分離的細(xì)菌菌株點(diǎn)接于平板,于28℃下培養(yǎng)48h后觀察、測量抑菌圈大小。1.5試驗(yàn)用病犯病株番茄種子播于裝有無菌土(菜園土∶沙=1∶1)的盆缽中,每盆25粒。40d后選生長較為一致的植株進(jìn)行移栽,然后用灌根法接種濃度為108cfu·mL-1的拮抗菌5mL·株-1(設(shè)不接病菌為空白對照,清水為陰性對照),48h后接種濃度為109cfu·mL-1青枯病菌5mL·株-1,每處理30株,從出現(xiàn)第1株病株開始,每天調(diào)查發(fā)病情況,進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。病情分級:0級為無癥狀;1級為1～2個葉片萎蔫;2級為全株1/3～1/2葉片萎蔫;3級為全株1/2～3/4葉片萎蔫;4級為全株3/4以上葉片萎蔫或死亡。防效(%)=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100。1.6測定根結(jié)指數(shù)和根冠重量的測定取生長一致的2葉番茄移栽于混合土壤(菜園土∶沙=1∶1)中,用灌根法接種濃度為108cfu·mL-1的拮抗菌5mL·株-1(設(shè)不接線蟲為空白對照,清水為陰性對照),然后鉆孔接種根結(jié)線蟲卵約500個·株-1,每處理3個重復(fù),每個重復(fù)3株,7～8周后參照文獻(xiàn)的方法調(diào)查根結(jié)指數(shù)和根冠重量,如空白對照出現(xiàn)根結(jié)或青枯病癥,則認(rèn)為試驗(yàn)無效。防效=[(對照組根結(jié)指數(shù)-處理組根結(jié)指數(shù))/對照組根結(jié)指數(shù)]×100%。1.7接種細(xì)菌,接種根結(jié)線蟲青枯病菌和根結(jié)線蟲的接種量同1.5和1.6,設(shè)以下7種處理:①M(fèi)2:二葉期單獨(dú)接種線蟲;②M2+R:二葉期接種線蟲+30d后接種細(xì)菌;③M4:四葉期單獨(dú)接種線蟲;④M4+R:四葉期接種線蟲+15d后接種細(xì)菌;⑤MR:二葉期后30d,同時接種細(xì)菌和線蟲;⑥R+M:二葉期后30d接種細(xì)菌+10d后接種根結(jié)線蟲;⑦R:二葉期后30d單獨(dú)接種細(xì)菌;⑧設(shè)不接種病原為陰性對照(CK)。每處理3個重復(fù),每個重復(fù)8株。線蟲病情調(diào)查:接種細(xì)菌前,每個重復(fù)取4株扣盆法調(diào)查其根結(jié)線蟲發(fā)病率;接種細(xì)菌后,于病情穩(wěn)定時每個重復(fù)取剩余4株進(jìn)行調(diào)查。青枯病病情調(diào)查:于接種細(xì)菌后每日觀察記錄,病情分級同1.5。1.8發(fā)病情況調(diào)查番茄種子經(jīng)拮抗菌浸種處理12h后,播于混配自然土(菜園土∶沙=1∶1)中,待長至二葉期時,移栽入含根結(jié)線蟲的病土中,每處理42株,20d后再次以灌根法接種拮抗菌(接種濃度108cfu·mL-1),2d后接種濃度為2×107cfu·mL-1的青枯病菌,從出現(xiàn)第1株病株開始記錄每天的發(fā)病情況,并統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。病株枯萎后扣盆調(diào)查根結(jié)線蟲發(fā)病情況。1.9序列原位排列按文獻(xiàn)的方法對防治效果較好的菌株進(jìn)行傳統(tǒng)鑒定;測定部分菌株的16SrDNA序列,所獲序列經(jīng)DNAman軟件編輯,去除末端的不完整堿基片段,對序列同源性進(jìn)行初步分析;再利用ClustalW軟件進(jìn)行序列對位排列。ClustalW軟件參數(shù)設(shè)置為:slow/accurate,gapopeningpenalty:15.00,gapextensionpenalty:6.66,delaydivergentsequences:30%,DNAtransitionsweight:0.50,negativematrix:off,DNAweightmatrix:IUB,序列以phylip格式輸出。輸出文件經(jīng)Mega3.0轉(zhuǎn)化成meg格式后,基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離,使用Neighbor-joining法進(jìn)行參數(shù)估計(jì),由此生成進(jìn)化樹文件。1.10數(shù)據(jù)分析利用生物統(tǒng)計(jì)軟件DPS(V6.55)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)分析方法采用Duncan氏新復(fù)極差測驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1篩選n6、en9、en5和sb1的活性對分離菌株抑制番茄青枯病菌的能力進(jìn)行測定,獲得13株具有不同程度抑制活性的菌株,其中菌株EN1、EN6、EN9、EN15、SB1和SB2的抑制活性較高,抑菌圈大小達(dá)19.6～26.3mm(表1);除菌株EN16和SW1外,其他菌株還能同時抑制多種土傳病原真菌的生長,尤其是菌株EN5、EN6、EN9和EN15,均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用。這些拮抗菌株的廣譜抗菌活性,更利于它們后期的生防應(yīng)用。2.2以病情指數(shù)為依據(jù)的不同防效情況試驗(yàn)分4組測定13個菌株對番茄青枯病溫室防效的變化情況。結(jié)果顯示(圖1),拮抗細(xì)菌的防效變化大致可以歸為3類:第1類菌株能持續(xù)作用,防效較為穩(wěn)定,雖然后期有所下降,但仍能保持在較高的水平,如菌株EN1、EN5、EN15、SB1、EN01和EN16;第2類菌株在對照病情指數(shù)低時具有較高的防效,但隨著病情的發(fā)展,防效迅速下降,如菌株EN9;第3類菌株的起始防效不高,且呈持續(xù)下降的趨勢,或雖有所上升,但仍處于較低水平,如菌株EN6、SB2、SV3等。綜合各時段的防治效果來看,第1類菌株的平均防效均高于40%,其中以EN5、EN15、EN01和EN16的防效較高,平均防效分別為70.82%、89.54%、85.38%和78.81%。與2.1結(jié)果相比較,拮抗菌的抑菌能力強(qiáng)弱與溫室防效高低并不呈正相關(guān),這說明分離的拮抗菌株可能還存在抑菌作用之外的其他防病機(jī)理。2.3對根結(jié)線蟲的防效在第1組試驗(yàn)結(jié)果(表2)中,菌株EN15、EN16、SB2和SW1處理的番茄植株生長較快,其根系中根結(jié)較小,側(cè)根生長茂盛,根系受損程度遠(yuǎn)小于對照,它們對番茄根結(jié)線蟲的防效在40%左右。第2組試驗(yàn)結(jié)果(表2)中,菌株EN5、EN6和EN9也能緩解根結(jié)線蟲病的矮化現(xiàn)象,對根結(jié)線蟲病的防效在40%～50%之間;從兩組試驗(yàn)可以看出,經(jīng)防病效果好的菌株處理后,番茄的根結(jié)指數(shù)較低,植株趨于正常生長,根冠重顯著高于清水對照和培養(yǎng)基對照,地上部的差別尤為明顯;而經(jīng)防效不佳的菌株處理后,番茄生長情況與清水對照或培養(yǎng)基對照差別不大。因此,植株地上部生長情況的變化既是根結(jié)線蟲侵染的主要表征之一,也可作為衡量菌株防效的一個參考指標(biāo)。2.4接種根結(jié)線蟲的培養(yǎng)接種試驗(yàn)結(jié)果表明(表3),兩種病原在番茄上存在復(fù)合侵染關(guān)系,根結(jié)線蟲的介入加重了番茄青枯病的發(fā)病程度。根結(jié)線蟲接種越早,青枯病發(fā)病的潛伏期越短,發(fā)病程度也越嚴(yán)重。青枯病病情調(diào)查結(jié)果顯示,接種根結(jié)線蟲的處理均比單獨(dú)接種青枯菌株的處理發(fā)病嚴(yán)重,其中以處理2(二葉期接種線蟲,30d后接種青枯病菌)發(fā)病間隔期最短,病癥最為嚴(yán)重。另一方面,青枯病菌也對根結(jié)線蟲的侵染有一定的促進(jìn)作用,從表3中可看出處理2的根結(jié)指數(shù)明顯高于處理1。2.5根結(jié)線蟲防治以2.4結(jié)果中處理2的方法測定EN5、EN15等7個菌株對青枯-根結(jié)復(fù)合侵染病害的防治效果(表4)。菌株EN5、SB2和SW1處理后的番茄根系中根結(jié)明顯較小,有效減緩了根結(jié)線蟲對番茄青枯病的加重危害,從而降低青枯病的發(fā)病率,也使植株的生長量保持較高水平。其中SW1施用后,根結(jié)線蟲指數(shù)降至2.50,青枯病防效達(dá)62.39%,防治作用明顯優(yōu)于菌株EN5和SB2;而SB2對青枯病的防治效果并不理想(圖1C),但其對根結(jié)線蟲病的防治作用(表2)有效地提高了植株對青枯病的抗性,在復(fù)合病害的控制中也表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。2.6芽孢桿菌的結(jié)構(gòu)鑒定綜合以上篩選結(jié)果,對防病效果較好的菌株EN5、SB2和SW1進(jìn)行了初步鑒定。培養(yǎng)形態(tài)觀察和常規(guī)生理生化測定表明,3個菌株均是革蘭氏陽性菌,菌體呈桿狀,產(chǎn)芽孢,兼性厭氧,在7%NaCl和pH5.7中生長,接觸酶、V.P反應(yīng)陽性;淀粉水解反應(yīng)、硝酸還原反應(yīng)呈陽性,參照文獻(xiàn)的芽孢桿菌鑒別特征表,初步鑒定3個菌株均為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。將菌株16SrDNA序列與GenBank中芽孢桿菌的相應(yīng)序列進(jìn)行比對,結(jié)果表明(圖2),3個菌株與B.subtilis及枯草芽孢桿菌內(nèi)生亞種位于同一分支,其中,SB2和SW1與B.subtilis同源性較高,共同構(gòu)成一個小分支,而EN5與枯草芽孢桿菌中的內(nèi)生亞種遺傳距離較小。16SrDNA分析結(jié)果與常規(guī)生化鑒定的結(jié)果基本一致,因此,將3個菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。3生防菌株的篩選及聯(lián)合控病作用的研究本試驗(yàn)分別從根圍和根內(nèi)分離到數(shù)量相當(dāng)?shù)木?從平板抑菌活性初篩結(jié)果看來,根內(nèi)活性菌株的數(shù)量明顯多于根圍菌株,在番茄青枯病控病試驗(yàn)中,根內(nèi)菌株的防效也比根圍分離細(xì)菌的防效更高。研究表明,定殖于植物內(nèi)部的細(xì)菌具有更為安全穩(wěn)定的生存環(huán)境,有利于其更好地發(fā)揮功能。在本試驗(yàn)中,由根內(nèi)分離的菌株是否也較易在植株體內(nèi)穩(wěn)定增殖并遷移,從而直接抑殺導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖的青枯病菌?在下一步試驗(yàn)中,將通過調(diào)查有效菌株的內(nèi)生性和定殖力情況,深入分析番茄青枯病生物防治中菌株內(nèi)生性與防治作用的相關(guān)性。在番茄根結(jié)線蟲病的控制方面,情況則有所不同,根表細(xì)菌似表現(xiàn)出更好的防治作用。前人的研究表明,根際細(xì)菌主要通過改變根系的營養(yǎng)分泌情況達(dá)到其防病作用。本文分離的根表細(xì)菌是通過大量占據(jù)根表位點(diǎn)并參與根圍生理生化代謝,改變根圍的營養(yǎng)結(jié)構(gòu),從而形成不利于根結(jié)線蟲生長的環(huán)境,有效控制根結(jié)線蟲病,還是通過直接的抑殺作用實(shí)現(xiàn)生物控制?而根內(nèi)細(xì)菌的生防機(jī)理又如何?這些問題均需要進(jìn)一步的試驗(yàn)加以分析和驗(yàn)證。隨著植物病理學(xué)研究的深入,人們已發(fā)現(xiàn)自然界中許多植物病害的發(fā)生并非僅由一種病原物引起,而往往是以一種病原為主,一種或兩種其他病原參與作用形成的復(fù)合侵染,這種侵染造成的損失遠(yuǎn)甚于單一病原引起的損失。雖然早在20世紀(jì)50至70年代已經(jīng)證實(shí)了復(fù)合侵染病害的存在,并明確了各病原的相互作用關(guān)系,但從這方面著手進(jìn)行病害控制的研究卻很少。而利用活性菌株控制青枯病菌與根結(jié)線蟲復(fù)合侵染的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)中,在利用生防菌株防治這類復(fù)合侵染病害時,通過盆栽試驗(yàn)從13株對青枯病或根結(jié)線蟲病有不同防效的菌株中篩選得到3株對復(fù)合侵染病防效較好的菌株。從整個篩選結(jié)果來看,多數(shù)菌株只對其中的一種病原具有較好的防治作用,對兩種病癥都有控制作用的菌株只占少數(shù)。而在生物防治應(yīng)用中僅靠單一菌株難以獲得穩(wěn)定持續(xù)的控病效果,對兩種病原引起的復(fù)合病害尤是如此,因此,有必要對具有不同活性的菌株進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合以加強(qiáng)防治效果