grp79、cr、erp57蛋白與hpv16型感染在維吾爾族和漢族婦女中的表達(dá)及相關(guān)性分析

grp79、cr、erp57蛋白與hpv16型感染在維吾爾族和漢族婦女中的表達(dá)及相關(guān)性分析

hp感染是子宮頸癌的主要原因，尤其是hp16。而MHC-Ⅰ類分子是介導(dǎo)T細(xì)胞免疫,處理病毒相關(guān)抗原的關(guān)鍵分子。有研究證實(shí)90%的子宮頸癌組織細(xì)胞表面MHC-Ⅰ類抗原表達(dá)缺失。機(jī)體抗腫瘤的效應(yīng)細(xì)胞的激活主要是通過鈣網(wǎng)蛋白(calreticutin,TCR)識(shí)別MHC-Ⅰ類分子及其呈遞的內(nèi)源性抗原肽所構(gòu)成的復(fù)合體來進(jìn)行;如果MHC-Ⅰ表達(dá)異常,導(dǎo)致對(duì)癌抗原提呈、識(shí)別和殺傷作用發(fā)生障礙,即腫瘤細(xì)胞抗原肽無法被識(shí)別,從而使HPV感染后受損傷的細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視,發(fā)展為原位癌、浸潤(rùn)癌或轉(zhuǎn)移等。研究發(fā)現(xiàn),在癌前病變和癌變時(shí),由于腫瘤細(xì)胞MHC-Ⅰ類分子和TAP蛋白的表達(dá)減少引起抗原提呈缺陷,從而不能有效的引發(fā)細(xì)胞免疫。因此有關(guān)于與MHC-Ⅰ類分子相關(guān)蛋白的研究就十分重要。目前,關(guān)于子宮頸癌組織中這3種蛋白在維吾爾族與漢族之間表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道在國內(nèi)外的研究尚未見報(bào)道,故該實(shí)驗(yàn)主要為了研究葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucoseregulatedprotein78,GRP78)、CRT、ERP57(GRP58)蛋白在維、漢子宮頸癌中的表達(dá)情況,以及與HPV16感染在維、漢子宮頸癌中的相關(guān)性。1材料和方法1.1試劑與pcr收集2002～2007年間新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及喀什地區(qū)人民醫(yī)院子宮頸炎組織69例,其中漢族38例,維吾爾族31例;子宮頸癌124例,漢族36例,維吾爾族88例。免疫組化試劑檸檬酸抗原修復(fù)液(pH6.0),Mayer蘇木精復(fù)染液,二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒(均購自于北京中杉金橋公司),一抗GRP78(美國SANTA公司,1∶100)、CRT(美國SANTA公司,1∶400)、ERP57(美國ABCOME公司,1∶150)。PCR所用試劑蛋白酶K、PCR試劑盒、DEPC處理水、瓊脂糖、100bpDNALadderMarker購自大連寶生公司;5×TBE、1×TE、酚∶氯仿∶異戊醇(pH8.0)(25∶24∶1)、UNIQ-10純化柱購自上海生工公司。1.2方法1.2.1胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染成黃色或棕褐色為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。用光鏡下檢查顯色反應(yīng),GRP78、CRT、ERP57均在胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá),棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。根據(jù)陽性細(xì)胞在子宮頸上皮中所占面積分為5個(gè)等級(jí):<5%為(-)、10%～25%為(+)、25%～50%為(++)、50%～75%為(+++)、>75%為(++++)。陰性對(duì)照為等量PBS替代一抗的子宮頸組織。1.2.2pcr擴(kuò)增條件從10%福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中提取DNA,HPV16上游引物序列5′-GGTCGGTGGACCGGTCGATG-3′,下游引物序列5′-GCAATGTAGGTGTATCTCCA-3′,HPV16型基因組PCR擴(kuò)增片段大小為96bp,PCR擴(kuò)增條件為(95℃預(yù)變性3min,循環(huán)1次,95℃變性15s,60℃退火20s,72℃延伸25s循環(huán)40次,72℃7min循環(huán)1次,4℃保存),PCR總反應(yīng)體積為50μl[TaKaRaExTaq(5U/μl)0.3μl、10×ExTaqBuffer(Mg2+Plus)5μl、dNTPMixture(每次2.5mmol/L)4μl、模板DNA5μl、引物1、2(20pmol/ml)2μl,加DEPC處理水至50μl]。1.3進(jìn)行率的比較和關(guān)聯(lián)性分析采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較和關(guān)聯(lián)性分析。等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman秩相關(guān)分析數(shù)據(jù),運(yùn)用列聯(lián)系數(shù)表示。2結(jié)果2.1grp78、crt和ep57的蛋白GRP78、CRT、ERP57的陽性細(xì)胞胞質(zhì)均呈棕黃色或棕褐色,少數(shù)細(xì)胞核偶見GRP78、CRT、ERP57棕褐色染色(圖1～3)。2.2電泳wf將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳(100V,10min;60V,1h),經(jīng)GelDocEQ凝膠成像儀(BIO-RAD成像(圖4)。2.3在子宮頸癌和子宮頸炎中，grp78、crt和ep57骨髓3grp鋼在實(shí)體癌治療及相關(guān)癌組織中的表達(dá)HPV感染是子宮頸癌的主要病因。尤以HPV16最突出(占HPV感染率40%～60%),屬于高危型HPV。作為與介導(dǎo)抗病毒T細(xì)胞免疫相關(guān)的關(guān)鍵分子MHC-Ⅰ類分子,參與和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,決定疾病易感性的個(gè)體差異,腫瘤病毒感染相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)是對(duì)這一系列的組裝和負(fù)載過程中所參與的相關(guān)蛋白GRP78、CRT、ERP57進(jìn)行的研究。郝治等報(bào)道新疆地區(qū)維吾爾族婦女子宮頸癌中HPV16的感染率達(dá)58.06%(36/62),并高于漢族婦女子宮頸癌中HPV16的感染率16.67%。海米提等報(bào)道中國新疆HPV16基因與該地區(qū)宮頸癌高發(fā)存在一定的聯(lián)系。該研究中表明子宮頸癌中HPV16的感染率(31.45%)遠(yuǎn)高于子宮頸炎中HPV16的感染率(11.59%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而在民族之間比較時(shí)發(fā)現(xiàn),新疆維吾爾族婦女子宮頸癌中HPV16的感染率達(dá)40.91%(36/88),遠(yuǎn)高于在漢族婦女子宮頸癌中的表達(dá)率8.33%(3/36)。這表明,新疆維吾爾族婦女對(duì)HPV16型病毒的易感性高于漢族。GRP78被認(rèn)為是Hsp70家族的成員之一。GRP能調(diào)節(jié)蛋白的折疊與裝配,并具有細(xì)胞保護(hù)作用,或是轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡因子、葡萄糖載體作用。生理情況下,GRP78在真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上通過與新生多肽以非共價(jià)鍵形式短暫地結(jié)合,隨后松開,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和裝配,并協(xié)助蛋白質(zhì)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn),將其轉(zhuǎn)運(yùn)到一定的位置;在實(shí)體腫瘤內(nèi),GRP78能轉(zhuǎn)移內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊蛋白,保持細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下蛋白質(zhì)合成的繼續(xù),因此腫瘤細(xì)胞也存在GRP78的保護(hù)作用,GRP78可降低細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力,促進(jìn)腫瘤的生成和抗藥性產(chǎn)生,防止腫瘤細(xì)胞凋亡。近期在對(duì)各種腫瘤組織標(biāo)本的研究中均發(fā)現(xiàn),GRP78的產(chǎn)生還可以減少腫瘤細(xì)胞的凋亡,GRP78的高表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān)。劉榮華、劉艷紅等報(bào)道,GRP78在乳腺癌及肝癌組織中呈高表達(dá);Fernandez等觀察到在惡變的乳腺癌組織中GRP78過度表達(dá),而在良性病變中沒有此種蛋白的表達(dá)。而Mario等在前列腺癌患者血清分離出抗GRP78抗體。張新晨等運(yùn)用半定量RT-PCR顯示胃癌組織與正常組織中GRP78的表達(dá),結(jié)果顯示,GRP78在胃癌中的表達(dá)高于正常組。該研究結(jié)果表明:GRP78在子宮頸癌中的陽性表達(dá)率(95.16%)高于宮頸炎組(86.96%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在子宮頸癌中,GRP78的表達(dá)與HPV16的感染存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.278,P<0.05)。同時(shí),GRP78在漢族婦女宮頸炎中的陽性表達(dá)率(81.58%)與漢族婦女子宮頸癌組(100%)之間存在不同,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此說明,GRP78在子宮頸癌組織中呈高表達(dá),并隨著宮頸病變的發(fā)展呈增高趨勢(shì),這與Lee的研究報(bào)道一致,說明子宮頸癌導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,使得GRP78的誘導(dǎo)和合成明顯增加,降低了細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力,使得腫瘤細(xì)胞逃離了免疫監(jiān)視,從而減少了腫瘤細(xì)胞的凋亡,并且有可能通過影響凋亡效應(yīng)器的作用來阻斷化學(xué)藥物引起的細(xì)胞死亡。Vilatoba等報(bào)道,GRP78在子宮頸癌中的高表達(dá)可能是由于子宮頸癌生長(zhǎng)速度過快,導(dǎo)致局部缺氧、缺血、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏及毒物等原因使GRP78代償性增多和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生所致,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果分析:作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,參與一系列MHC-Ⅰ類分子轉(zhuǎn)配所需的重要因子的GRP78,起著促發(fā)α鏈于β2-MG結(jié)合總過程中提供能量的重要作用。杜靖等報(bào)道β2-MG在宮頸鱗癌組織中低表達(dá),由于β2-MG的低表達(dá),致使MHC-Ⅰ類分子在子宮頸癌中的表達(dá)下調(diào),而這一連續(xù)動(dòng)作的終止或下調(diào),可能使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中GRP78大量代償性增多。CRT是一類可溶性并存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的熱休克蛋白,具有多種生物學(xué)功能,包括參與腫瘤抗原提呈、血管的發(fā)生及細(xì)胞的凋亡等。多種腫瘤組織中CRT表達(dá)有明顯的改變,并與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后相互關(guān)聯(lián)。Mancino等發(fā)現(xiàn)CRT能識(shí)別內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的MHC-Ⅰ類分子重鏈。除此以外,CRT還能結(jié)合抗原肽,在內(nèi)源性抗原加工途徑中起增強(qiáng)抗原遞呈作用,這可能是它致病機(jī)制之一。相反地,CRT通過增強(qiáng)抗原遞呈,誘導(dǎo)抗原肽特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。近年許多研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤中CRT有量的改變,提示其可能作為一種新的腫瘤標(biāo)記物,有利于協(xié)助腫瘤的早期診斷。Chiqnard等通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析得出,CRT在肝癌患者中的表達(dá)高于肝癌高危人群及正常人;Kageyama等用窄pH范圍雙向電泳法分析發(fā)現(xiàn),膀胱癌變組織中的CRT高于正常組織;該學(xué)者還用CRT抗體檢測(cè)CRT蛋白,以鑒定其敏感性和特異性,結(jié)果顯示敏感性為73%、特異性為86%;Hsu等研究結(jié)果顯示,47.1%的成神經(jīng)細(xì)胞瘤患者CRT表達(dá)陽性,并且CRT的表達(dá)量與分化程度密切相關(guān)。該研究結(jié)果表明:CRT蛋白在子宮頸癌中的陽性表達(dá)率(90.32%)均高于宮頸炎組(50.72%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這與上述學(xué)者的研究結(jié)果報(bào)道一致。在子宮頸癌組織中,CRT在子宮頸癌中的表達(dá)與HPV16的感染存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.429,P<0.05)。鑒于CRT是MHC-Ⅰ類分子轉(zhuǎn)配過程中CNX/CRT分子伴侶系統(tǒng)不可缺少的組成成分,結(jié)合杜靖等報(bào)道,由于CNX在子宮頸癌中的低表達(dá)致使MHC-Ⅰ類分子在子宮頸癌中的表達(dá)下調(diào),而這一連續(xù)動(dòng)作的終止或下調(diào),可能使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中CRT大量代償性增多。綜上所述,CRT可作為制定治療計(jì)劃與評(píng)價(jià)預(yù)后的有用指標(biāo)。以上這些研究可表明,CRT有望成為多種腫瘤的新標(biāo)記物,協(xié)助早期診斷。ERP57又名葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白58(glucoseregulatedprotein58,GRP58),被認(rèn)為是蛋白二硫化物異構(gòu)酶(PDI)家族成員之一。ERP57作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中的一種重要分子伴侶,在細(xì)胞內(nèi)是以一種可溶形式存在,具有巰基依賴性氧化還原酶活性,是促進(jìn)正常生長(zhǎng)狀態(tài)下細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成、維持細(xì)胞機(jī)能和生命的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)。ERP57在真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上通過自身的2個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域,以二硫鍵與新生多肽相結(jié)合,形成短暫的中間產(chǎn)物,然后分開,從而促進(jìn)新生多肽的正確折疊和裝配,并協(xié)助新生多肽跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn),將其轉(zhuǎn)運(yùn)到指定的位置。因此在MHC-Ⅰ類分子表達(dá)缺失的腫瘤中,ERP57的表達(dá)有助于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。Celli等研究發(fā)現(xiàn),ERP57在乳腺癌、子宮癌、肺癌和胃癌中均較對(duì)應(yīng)的癌旁組織表達(dá)上調(diào);反過來,腫瘤細(xì)胞的大量增殖,也促進(jìn)ERP57表達(dá)的增加。在正常大鼠腎臟細(xì)胞轉(zhuǎn)入病毒致癌基因轉(zhuǎn)化子后,研究者發(fā)現(xiàn)ERP57的蛋白水平升高。該研究結(jié)果表明:ERP57蛋白在子宮頸癌中的陽性表達(dá)率(90.32%)均高于子宮頸炎組(49.28%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),ERP57蛋白在子宮頸癌中呈高表達(dá)。在子宮頸癌組織中,ERP57的表達(dá)與HPV16的感染存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.222,P<0.05)。但是通過在民族之間進(jìn)行比較時(shí)我們發(fā)現(xiàn),ERP57蛋白在漢族婦女宮頸炎中的陽性表達(dá)率(60.53%)高于維吾爾族宮頸炎組(35.48%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明ERP57在子宮頸癌組織中呈高表達(dá)趨勢(shì),作為參與一系列MHC-Ⅰ類分子轉(zhuǎn)配所需的重要因子,ERP57在構(gòu)成CNX/CRT分子伴侶系統(tǒng)過程中是不可或缺的組成成分。杜靖等報(bào)道,由于CNX在宮頸癌中的低表達(dá)致使MHC-Ⅰ類分子在宮頸癌中的表達(dá)下調(diào),而這一連續(xù)動(dòng)作的終止或下調(diào),可能使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ERP57大量代償性增多。而進(jìn)入宮頸癌時(shí)期,ERP57在漢族子宮頸癌組織中