胡蘆巴多糖的解酶解對(duì)腸道菌體外生長(zhǎng)的影響

胡蘆巴多糖的解酶解對(duì)腸道菌體外生長(zhǎng)的影響

胡蘆巴是科西嘉陽(yáng)屬的一種一年生草本植物。它也被稱為香豆、高粱和木蘭。胡蘆巴多糖是由胡蘆巴種子內(nèi)胚乳中提取出的一種多糖膠,主要成分為半乳甘露聚糖,其分子式為:(C6H10O5)n·2H2O,分子量接近250,000,這類高分子多糖可作為增稠劑、穩(wěn)定劑等,廣泛應(yīng)用于食品、石油、紡織、造紙等領(lǐng)域[2~4]。胡蘆巴多糖具有較高的應(yīng)用價(jià)值,作者所在的課題組及國(guó)內(nèi)其他同行已經(jīng)從不同角度對(duì)葫蘆巴中性多糖進(jìn)行研究,主要集中在其粘度、流動(dòng)性、降血糖效應(yīng)等方面,而在其水解物對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響等方面尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。本文比較研究了胡蘆巴多糖酸解和酶解的不同產(chǎn)物對(duì)腸道菌群體外生長(zhǎng)的影響,以期為胡蘆巴多糖在功能性食品和醫(yī)藥保健等領(lǐng)域中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有價(jià)值的資料。1材料和方法1.1半乳糖-糖酸解產(chǎn)物按本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)告的水解工藝制備葫蘆巴多糖酸解和酶解產(chǎn)物,酸解產(chǎn)物為分子量范圍500~1000的低聚糖,酶解產(chǎn)物為分子量范圍7500~10000的半乳糖甘露聚糖片斷。1.1.1菌株菌株—菌種青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、大腸桿菌(E.Coli)由南京師范大學(xué)微生物研究所提供;乳酸桿菌(Lactobacillus)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物研究室提供。1.1.2hyp3-4-nacle-4-甲基苯磺酸鹽酸鹽緩沖液1.2.0g,khpo1.3.4.5g,khpo1.4.5.4.5.4.5%hs3.0.5%h.7.4.5%h.7.4.5%h.7.4.5%h.7.4.5%h.5g,khpo3.5%h.5%h.7.4.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.3.5%h.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,khpo3.5g,cacl3.5g,sas3.5.4.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5g,sas3.5.4.5.4.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%h.5%雙歧桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基:大豆蛋白胨0.5g,胰蛋白胨0.5g,酵母粉1.0g,葡萄糖1.0g,半胱氨酸鹽酸鹽0.05g,無(wú)機(jī)鹽液4.0mL(每1L含NaHCO310g,CaCl20.2g,K2HPO41.0g,K2HPO41g,MgSO4·7H2O0.48g,NaCl2g),H2O100mL,pH7.0;乳酸桿菌采用MRS培養(yǎng)基,大腸桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1終濃度的確定將酸解和酶解后形成的低聚糖或多糖片段配制成0.2%、1.0%、2%、4%、10%5種濃度的水溶液,等量加入相應(yīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基,使終濃度為0.1%、0.5%、1%、2%、5%。以此培養(yǎng)基作為各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基,加等濃度蔗糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照組培養(yǎng)基。1.2.2測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)量的結(jié)合體離心沉淀定量稀釋后在600nm處測(cè)其OD值,以O(shè)D值代表其生長(zhǎng)量。1.2.3雙歧桿菌od值測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的培養(yǎng)基以5%的比例分別加入青春雙歧桿菌菌懸液,37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間,取菌懸液測(cè)OD值。觀察不同時(shí)間和不同濃度的酸解和酶解產(chǎn)物對(duì)雙歧桿菌生長(zhǎng)的影響。1.2.4影響乳酸桿菌的因素各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基以5%的比例分別加入乳酸桿菌菌懸液。37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),取菌懸液測(cè)其OD值。1.2.5影響桿菌的因素各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基以5%的比例分別加入大腸桿菌菌懸液。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),取菌懸液測(cè)OD值。1.2.6活菌數(shù)的計(jì)算采用10倍稀釋滴注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每毫升培養(yǎng)基中的活菌數(shù)(cfu)為:細(xì)菌菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×100,結(jié)果換算成以10為底的對(duì)數(shù)進(jìn)行分析。1.2.7統(tǒng)計(jì)分析方法:univararate自適應(yīng)變化,univarara官采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值,采用Univariate進(jìn)行分析,各處理組之間差異采用Duncan檢驗(yàn),以P<0.05為顯著性差異,P<0.01表示極顯著性差異。2結(jié)果與分析2.1不同形式的高純度葡萄糖對(duì)年輕雙叉菌的生長(zhǎng)影響2.1.1影響雙歧桿菌生長(zhǎng)的單因素試驗(yàn)圖1中可以看出,培養(yǎng)48h后,各實(shí)驗(yàn)組的OD值均高于對(duì)照組,表明在相同濃度的情況下,酸解和酶解產(chǎn)物比蔗糖更有利于雙歧桿菌生長(zhǎng)。此外,隨著加入的水解產(chǎn)物及蔗糖濃度的增加,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD值均呈上升趨勢(shì),表明一定濃度范圍內(nèi)葫蘆巴多糖水解產(chǎn)物和蔗糖促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的效應(yīng)有量效關(guān)系。當(dāng)加入的水解產(chǎn)物濃度達(dá)到1%時(shí),酸解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的OD值是同期對(duì)照的1.13倍(P<0.05);酶解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的OD值是對(duì)照的1.44倍(P<0.01),表明在該濃度下酶解產(chǎn)物更有利于促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。隨著加入物濃度的繼續(xù)增大,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OD值上升均趨于平緩。2.1.2在圖2中，1%天竺葵糖提取物和新豐原的不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)年輕雙尖菌的影響圖。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的od值呈現(xiàn)先升后升的趨勢(shì)，在48小時(shí)內(nèi)的od值最高，這種下降可能與碳源和其他養(yǎng)分的消耗有關(guān)。結(jié)果表明，在這種實(shí)驗(yàn)條件下，最好在48小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)年輕的雙尖菌。在這一點(diǎn)上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異達(dá)到了顯著水平，表明朔黑糖分解和酶分解產(chǎn)品對(duì)雙尖菌的生長(zhǎng)起到了積極作用。然而，在實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中，酸分解產(chǎn)物組p.0.05的od值低于酸分解產(chǎn)物組p.0.052.2酸解產(chǎn)物的濃度培養(yǎng)48h后不同濃度的胡蘆巴中性多糖酸解和酶解產(chǎn)物,對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表1。結(jié)果顯示,兩者無(wú)論是乳酸桿菌的活菌數(shù)和OD值均高于對(duì)照組,且隨著濃度增加,均呈遞增趨勢(shì),提示葫蘆巴多糖酸解和酶解的產(chǎn)物對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,且與其濃度有明顯的量效關(guān)系。酸解產(chǎn)物的濃度達(dá)到2%時(shí),活菌數(shù)是對(duì)照的1.24倍(P<0.05),OD值是對(duì)照的1.15倍(P<0.05);而同濃度的酶解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的活菌數(shù)和OD值分別是對(duì)照的1.37倍和1.30倍,均達(dá)到極顯著差異(P<0.01),可見(jiàn)在相同濃度的情況下,酶解產(chǎn)物比酸解產(chǎn)物更有利于乳酸桿菌的生長(zhǎng)。圖3是2%濃度的各水解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組平板培養(yǎng)48h的照片,可以看出,酸解和酶解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)均多于對(duì)照組,且酶解產(chǎn)物組更明顯。由表1還可見(jiàn),當(dāng)酸解和酶解產(chǎn)物的濃度增加至2%之后,再繼續(xù)增加其濃度,乳酸桿菌的活菌數(shù)及OD值與前者相比較并無(wú)顯著性提高,表明此時(shí)添加物的濃度已經(jīng)趨于飽和,提示在此實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)乳酸桿菌而言2%的添加量是合適的。2.3不同濃度對(duì)葫蘆巴多糖酶解產(chǎn)物的抑制效應(yīng)的影響由表2可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌的活菌數(shù)及OD值均隨著加入的酸解和酶解產(chǎn)物濃度的增加呈下降趨勢(shì),表明不管是葫蘆巴多糖的酸解,還是酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)都有較明顯的抑制作用,且呈現(xiàn)顯著的量效關(guān)系。濃度為2%的酸解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的活菌數(shù)是對(duì)照的89.0%(P<0.05),OD值是對(duì)照的89.3%(P<0.05),同濃度酶解產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)組的活菌數(shù)是對(duì)照的80.2%(P<0.01),OD值是對(duì)照的79.9%(P<0.01),可見(jiàn)葫蘆巴多糖的酶解產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌的抑制作用比其酸解產(chǎn)物更明顯。水解物的實(shí)驗(yàn)濃度達(dá)5%時(shí),其抑制效應(yīng)的增加趨于平緩。圖4是葫蘆巴多糖酸解和酶解產(chǎn)物2%實(shí)驗(yàn)組平板培養(yǎng)48h的照片,兩者的大腸桿菌菌落數(shù)均小于對(duì)照組,酶解產(chǎn)物組更顯著。3優(yōu)化腸道菌群生長(zhǎng)與酶解產(chǎn)物的關(guān)系生長(zhǎng)促進(jìn)因子包括多肽類、次黃嘧啶和低聚糖等,其中低聚糖類被認(rèn)為是最重要、最有效的生長(zhǎng)促進(jìn)因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究葫蘆巴多糖酸解和酶解的不同產(chǎn)物對(duì)腸道菌群體外生長(zhǎng)的影響,為進(jìn)一步探討其藥理、藥效奠定研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)比較胡蘆巴中性多糖不同分子量水解產(chǎn)物對(duì)腸道菌群體外生長(zhǎng)的影響,表明經(jīng)酸解和酶解后形成的產(chǎn)物均明顯促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長(zhǎng),抑制大腸桿菌的生長(zhǎng),且相同濃度的情況下,酶解產(chǎn)物對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響更明顯。這可能是因?yàn)槊附猱a(chǎn)物片斷大小適中,而酸解產(chǎn)物較之小得多,且在酸水解過(guò)程中,單糖之間的糖苷鍵或單糖上的某些基團(tuán)更易受到損傷或變形,而影響其生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,適當(dāng)分子量且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的低聚半乳甘露聚糖對(duì)腸道有益菌群的生長(zhǎng)和穩(wěn)定有促進(jìn)作用,對(duì)大腸桿菌有抑制作用,其機(jī)理特別是對(duì)大腸桿菌抑制作用的形成有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:在本實(shí)驗(yàn)條件下促雙歧桿菌生長(zhǎng)的葫蘆巴多糖水解產(chǎn)物的適宜濃度為1%,而乳