苦木中生物堿提取方法的比較及安全性評價

苦木中生物堿提取方法的比較及安全性評價

0臨床使用苦木制劑的研究[研究意義]苦木是苦木科苦木科植物，主要分布在廣東省和廣東省。其性苦、寒，歸肺、大腸經(jīng)?？嗄镜闹饕幱贸煞譃榍o、枝、葉所含的苦木素（Quassin）、異苦木素（Picrasmin）、苦樹素（Picrasin）、苦木酮堿（Nigakinone）等十幾種生物堿（沈保安和劉榮祿，2006）?，F(xiàn)已有研究證實，苦木具有抗菌消炎、解熱降壓、抗癌抗蛇毒等作用（中國醫(yī)學科學院藥物研究所，1996）。廣西獸醫(yī)研究所新獸藥開發(fā)中心利用廣西特有的優(yōu)勢中草藥資源，根據(jù)中獸醫(yī)辨證施治與標本兼治的原則，結(jié)合雞大腸桿菌病的臨床特點與病理特征，將苦木與黃藤、救必應、白術(shù)和廣藿香辨證組方，開發(fā)出復方苦木注射液，并應用于規(guī)?；B(yǎng)殖場雞大腸桿菌病防治，對推動綠色健康養(yǎng)殖、調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)具有積極作用?！厩叭搜芯窟M展】劉富國（1986）用苦木片預防仔豬白痢病，平均有效率達95.06%。王啟明（1995）經(jīng)臨床實踐證明，苦木制劑對治療豬的感冒、無名高熱、中暑等疾病均有效，尤其是治療豬感冒，有效率在98%以上。楊宗樺（1997）將苦木用于治療牛的蹄葉炎和急性眼結(jié)膜炎，也取得良好效果。本課題組的前期研究結(jié)果也表明，苦木對禽大腸桿菌有一定的體外抑菌效果（何穎等，2008）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外對苦木有效成分化學結(jié)構(gòu)的研究已有較大進展（陳猛等，2007；趙文娜等，2011），但有關苦木生物堿提取、檢測方法及毒理學方面的研究較少，苦木在中獸醫(yī)臨床上的應用研究也鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】以高效液相色譜測定方法，對乙醇回流提取法、乙醇滲漉提取法和酶解—乙醇滲漉提取法提取的苦木生物堿進行測定，篩選出最佳提取方法；同時對復方苦木注射液進行小鼠口服和腹腔注射的急性毒性試驗，評價其安全性，為優(yōu)化苦木生物堿有效成分的提取工藝及開發(fā)出有效治療畜禽大腸桿菌病的復方中藥注射液奠定基礎。1材料和方法1.1苦木、苦木注射液苦木藥材采自廣西馬山縣古零鎮(zhèn)，經(jīng)廣西獸醫(yī)研究所新獸藥開發(fā)中心鑒定為苦木科苦木屬植物。取其干燥枝、莖，切片，經(jīng)粉碎機3次粉碎成100目粗粉?？嗄緣A己、苦木堿丁標準品購自南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，分別含苦木堿己和苦木堿丁20mg。復方苦木注射液由廣西獸醫(yī)研究所新獸藥開發(fā)中心研制，為橙紅色澄明液體，采用苦木、黃藤、救必應、廣藿香等有效成分提取物按一定濃度配制成，1mL相當于原生藥1g。昆明小鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，雌雄各半，共120只，體重18±2g。1.2苦木生物提取1.2.1收乙醇、過濾、濃縮苦木粗粉100g→80%乙醇加熱回流→回收乙醇→濃縮成膏狀→10倍乙醇溶解→靜置過夜（pH9）→過濾、濃縮成膏→2%鹽酸溶液分次提取→濃縮至1mL∶1g生藥。1.2.2生藥的提取工藝苦木粗粉100g→80%乙醇（pH2）浸泡→滲漉（3mL/min）→濃縮成膏狀→10倍乙醇溶解→靜置過夜（pH9）→過濾、濃縮成膏→2%鹽酸溶液分次提取→濃縮至1mL∶1g生藥。1.2.3生藥的提取工藝苦木粗粉100g→酶解120min→80%乙醇（pH2）浸泡→滲漉（3mL/min）→濃縮成膏狀→10倍乙醇溶解→靜置過夜（pH9）→過濾、濃縮成膏→2%鹽酸溶液分次提取→濃縮至1mL∶1g生藥。1.3hso4提取精密量取苦木提取液20mL于蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，殘渣用10mLH2SO4(0.25mol/L）溶解，濾過；蒸發(fā)皿用0.05mol/LH2SO4洗滌兩次，每次10mL，濾過；合并濾液，移至分液漏斗中，用氯仿提取兩次，每次10mL；合并氯仿液，用0.25mol/LH2SO4振搖提取3次（10、10、5mL），棄去氯仿液，合并酸液，用濃氨試液調(diào)pH約10；然后用氯仿振搖提取5次（20、20、15、15、10、10mL），每次提取液均用10mL水洗滌，再通過無水硫酸鈉濾過，濾皿用4mL氯仿洗滌兩次，合并氯仿液，置水浴上蒸干，再105℃干燥3h，精密稱重即可。1.4標準曲線繪制采用高效液相色譜法，條件色譜柱:NucleosilC18(4mm×25cm,5μm）；流動相：60%甲醇-0.1%乙酸銨；流速0.5mL/min；檢測波長254nm。首先，配制1mg/mL苦木己堿、苦木丁堿的甲醇溶液，然后吸取對照品溶液250、100μL置于5mL量瓶中，以甲醇定容，分別吸取2、4、6、8、10μL進樣，按色譜條件測定，繪制標準曲線。取總生物堿測定項下生物堿1.0mg，精密稱量，溶于少量甲醇，通過中性氧化鋁小柱（25mm×6mm），用15mL甲醇洗脫，洗脫液揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解并稀釋至1mL即可。1.5復方苦木注射液選取50只昆明小鼠，雌雄各半，在人工照明12h、通風良好的條件下飼養(yǎng)觀察3d后，隨機分成4個試驗組和1個對照組，每組10只，給藥前8h和給藥后4h內(nèi)禁食，但不禁水?？诜?.5mL/20g劑量灌胃給藥，灌服劑量按復方苦木注射液總生物堿含量計算，分別為1000、2500、5000和10000mg/kg體重。連續(xù)觀察7d，記錄小鼠中毒癥狀，小鼠死亡或試驗結(jié)束后進行剖解，觀察各組織器官的變化，取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟及腸組織做病理切片，并計算半數(shù)致死量（LD50）。1.6體重和生物質(zhì)量標準選取70只昆明小鼠，雌雄各半，隨機分成6個試驗組和1個對照組，每組10只，給藥前18h和給藥后4h內(nèi)禁食，但不禁水。按總生物堿含量計算，各組分別按1100、1320、1584、1900、2281和2737mg/kg體重給藥。連續(xù)觀察7d，觀察小鼠的飲水食欲、活動及精神狀況，記錄小鼠死亡數(shù)，剖解肉眼觀察各組織器官的變化，按簡化寇氏法計算LD50。2結(jié)果與分析2.1酶解—不同提取方法所得苦木生物堿含量比較不同提取方法所得苦木總生物堿和苦木堿己、苦木堿丁含量測定結(jié)果見表1，苦木藥材和復方苦木注射液中的苦木堿己、苦木堿丁高效液相色譜圖見圖1和圖2。由表1可知，酶解—乙醇滲漉提取法提取的苦木總生物堿（3.10±0.22mg/mL）和苦木堿己（0.30±0.06mg/mL）、苦木堿?。?.05±0.01mg/mL）含量極顯著高于乙醇回流提取法和乙醇滲漉提取法（P<0.01）。由圖1和圖2可知，選用堿性含水流動相的NucleosilC18色譜柱，苦木堿己和苦木堿丁在254nm處有最大吸收值，且其色譜峰表觀豐度較高，基線也較平穩(wěn)，說明以高相液相色譜測定苦木生物堿，具有穩(wěn)定、準確、重復性好的特點。2.2小鼠臟器異常試驗用灌胃針經(jīng)口腔灌入復方苦木注射液后，個別小鼠蜷縮在角落，活動減少，但第2d觀察，發(fā)現(xiàn)有30只小鼠活動、飲水和采食恢復正常；連續(xù)觀察7d后，40只小鼠均健康存活（表2），且全部小鼠的精神、食欲、膚色、分泌物、呼吸、食欲、肌肉運動等方面均未觀察到異常變化。試驗結(jié)束后剖檢，發(fā)現(xiàn)各試驗組小鼠臟器變化與對照組無明顯眼觀差異。按照毒理學安全性評價標準（范玉明和張舒，2009）得知，LD50>10000mg/kg，屬無毒性物質(zhì)。2.3小鼠腸系膜變化復方苦木注射液的小鼠腹腔注射急性毒性結(jié)果見表3。腹腔注射復方苦木注射液2h后，部分昆明小鼠表現(xiàn)出興奮不安，痙攣，縮成一團，呼吸困難，隨后死亡。其他小鼠活潑程度不如對照組，采食量明顯減少，但飲水量增加。至第7d存活小鼠的采食、飲水恢復正常，活動自如。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)腸系膜充血，肝臟、脾臟腫大，被膜緊張，邊緣鈍圓，表面呈暗紫紅色，切面呈暗紅色，質(zhì)地變軟；心臟、腎臟體積均增大。用改良寇氏法計算，LD50=2336mg/kg，安全性評價為基本無毒物質(zhì)。涂片鏡檢可見脾臟呈急性脾炎變化，被膜下有大量紅細胞；肝臟匯管區(qū)有少量炎癥細胞浸潤，腎臟皮質(zhì)部可見部分蛋白管型，胃粘膜下層有輕度的炎癥細胞浸潤；心肌纖維核數(shù)量減少，肌纖維斷裂、崩解、溶解、消失，肌纖維間有一定量的紅細胞。隨著藥物劑量增大，小鼠死亡率增加，臟器病變也更加明顯。3復方苦木注射液傳統(tǒng)的提取方法如煎煮、有機溶劑浸出醇處理等，提取溫度高、提取率低、成本高、不安全，而選用適當?shù)拿缚蓪⒅参锝M織分解，加速有效成分釋放提取。大部分中藥材的細胞壁是由纖維素構(gòu)成，其有效成分往往包裹在細胞壁內(nèi)；纖維素是由β-D-葡萄糖以1,4-β葡萄糖苷鍵連接，而用纖維素酶酶解可以破壞β-D-葡萄糖鍵，使植物細胞壁破壞，有利于有效成分的提?。ㄓ嗯d蓮等，2007）。本研究中的酶解—乙醇滲漉法是采用β-纖維素分解酶對苦木的植物纖維素進行分解，所得的苦木總生物堿含量極顯著高于乙醇回流法和乙醇滲漉法，且該法提取的苦木堿己、苦木堿丁的含量與另外兩種方法相比差異也極顯著，說明β-纖維素分解酶能較大幅度提高苦木生物堿的提取率。復方苦木注射液由苦木、黃藤等中藥提取制備，具有清熱解毒、利濕消腫、健脾和中、燥濕止瀉、行氣通經(jīng)等功效，臨床常用于防治致病性大腸桿菌引起的腸炎、腹水綜合癥、漿膜炎、肺炎、輸卵管炎等癥。本研究對復方苦木注射液進行了急性毒性試驗，按注射液中總生物堿計算給藥劑量和毒性判定指標；在小鼠口服急性毒性試驗中，口服劑量超過1000mg/kg,7d后小鼠仍健康存活，按照藥物學急性毒性試驗標準，說明復方苦木注射液對小鼠口服安全無毒；在小鼠腹腔注射急性毒性試驗中，用改良寇氏法計算出LD50=2336mg/kg，根據(jù)標準判定，亦表明復方苦木注射液臨床治療安全性非常高，基本安全無毒。因此，在畜禽業(yè)中以復方苦木注射液代替抗生素對大腸桿菌等細菌