食線蟲真菌的侵染性胞外水解酶研究進(jìn)展

食線蟲真菌的侵染性胞外水解酶研究進(jìn)展

蠕蟲是一個(gè)線性的多細(xì)胞原生動(dòng)物，廣泛分布于海水、淡水和土壤中，其中一些可以寄生在植物和動(dòng)物身上。植物寄生線蟲可以引起多種經(jīng)濟(jì)作物的嚴(yán)重病害,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中危害最嚴(yán)重的線蟲包括根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)、胞囊線蟲(Heteroderaspp.)和松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)等。應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥雖然對(duì)病原線蟲有良好的防治效果,但是化學(xué)農(nóng)藥容易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和線蟲容易產(chǎn)生藥物抗性等缺點(diǎn),所以,研究殺線蟲生物資源和開發(fā)生物殺線蟲制劑日益受到關(guān)注。食線蟲真菌是指寄生、捕捉、定殖和毒害線蟲的一類微生物,它們?cè)谥参锏牟≡ハx和線蟲的生物防治中起著非常重要的作用。依據(jù)它們侵害線蟲的習(xí)性可以把它們分為捕食真菌(trappingfungi)、內(nèi)寄生真菌(endoparasiticfungi)、機(jī)會(huì)真菌(opportunisticfungi)和產(chǎn)毒真菌(toxicfungi)四大類群。其中寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysoligospora)、厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporium)和淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)等食線蟲真菌在侵染線蟲的過程中能夠分泌胞外酶并參與對(duì)線蟲體壁的降解和侵染過程。四個(gè)類群及其侵染方式只是相對(duì)而言,比如:白色單頂孢(Monacrosporiumcandidum)既可產(chǎn)生粘性球,又可產(chǎn)生非收縮環(huán);淡紫擬青霉既可以定殖于線蟲的孢囊、寄生雌蟲、卵,又可產(chǎn)生有毒物質(zhì)。對(duì)食線蟲真菌的研究表明蛋白酶等侵染性胞外酶在侵染線蟲的過程中起著非常重要的作用,然而,這些食線蟲真菌在自然條件下所產(chǎn)生和分泌的胞外酶的濃度是非常低的(1～2μg/L),所以提高食線蟲真菌的胞外蛋白酶的表達(dá)水平是提高線蟲生防制劑防效的關(guān)鍵。?hman等的研究工作表明應(yīng)用分子生物學(xué)手段構(gòu)建的含有多拷貝胞外蛋白酶(PII)編碼基因的突變株不僅能夠使生防菌株分泌更多的胞外酶,而且生防菌株的捕食能力也得到了極大的增強(qiáng),這也為食線蟲真菌的遺傳改造提供了較好的思路和方法。本文綜述了目前食線蟲真菌侵染性胞外酶的研究進(jìn)展,同時(shí)對(duì)面臨的一些問題進(jìn)行了探討。1寡孢節(jié)叢孢pii基因的誘導(dǎo)表達(dá)捕食線蟲真菌是一類營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成捕食器官(Predaciousdevices)捕捉線蟲的真菌,迄今報(bào)道的有12個(gè)屬,其中研究和應(yīng)用比較廣泛的有節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)、單頂孢屬(Monacrosporium)和隔指孢屬(Dactylella),這3個(gè)屬的親緣關(guān)系比較接近,根據(jù)我們對(duì)其中的一些菌株的初步研究結(jié)果,它們?cè)谇秩具^程中都能夠產(chǎn)生生化性質(zhì)相近的具有降解線蟲體壁的胞外絲氨酸蛋白酶。寡孢節(jié)叢孢是目前所研究的分子背景了解最清楚的捕食線蟲真菌,它對(duì)線蟲的侵染包括以下的生物學(xué)過程:首先是用三維菌網(wǎng)捕捉線蟲,菌絲黏附于線蟲的體表;接著菌絲分泌胞外酶降解線蟲的體壁,并穿透線蟲的體壁;最后消解線蟲的體內(nèi)組織并殺死線蟲。Tunlid等從寡孢節(jié)叢孢發(fā)酵液中純化了一種胞外絲氨酸蛋白酶PII,它不僅能夠固定全齒復(fù)活線蟲(Panagrellusredivius),而且能夠降解線蟲的體壁。?hman等克隆得到PII的編碼基因,隨后又構(gòu)建了含有多拷貝PII基因的突變株和PII基因缺失的突變株,檢測(cè)結(jié)果表明PII基因的多拷貝突變株能夠產(chǎn)生更多的捕食器官并且具有更快的捕食速度和殺死線蟲的能力,這是通過分子生物學(xué)手段提高捕食線蟲真菌捕食能力的首次報(bào)道;然而PII缺失的突變菌株的致病性并沒有受到明顯的影響,這表明在寡孢節(jié)叢孢中除了絲氨酸蛋白酶以外還有其它的毒力因子參與對(duì)線蟲的侵染過程。Zhao等也叢寡孢節(jié)叢孢中分離了一種和PII生化性質(zhì)相似的胞外中性絲氨酸蛋白酶Aoz1,它的編碼cDNA序列和PII的編碼基因同源性高達(dá)97%,氨基酸序列同源性為93%,由此推測(cè)Aoz1和PII很可能是具有相同功能的同功酶。Schenck等檢測(cè)了8種捕食線蟲真菌產(chǎn)生膠原蛋白酶的能力,發(fā)現(xiàn)所有的測(cè)試菌株都能產(chǎn)生膠原蛋白酶,并且生長(zhǎng)快的菌株酶活性也相對(duì)較高。Tosi等在Arthrobotrystortor的南極分離株中也檢測(cè)到膠原蛋白酶活性,他的研究結(jié)果表明這些捕食線蟲真菌產(chǎn)生的膠原蛋白酶是一種組成型胞外絲氨酸蛋白酶并參與對(duì)線蟲的侵染。盡管對(duì)寡孢節(jié)叢孢的胞外絲氨酸蛋白酶的分泌和線蟲的侵染過程的相關(guān)性已經(jīng)得到深入的研究,但對(duì)其它捕食線蟲真菌的胞外酶分泌尤其是分子機(jī)理方面的研究報(bào)道比較少。我們實(shí)驗(yàn)室自2000年以來對(duì)食線蟲真菌分泌的與侵染相關(guān)的胞外酶及相關(guān)基因做了較系統(tǒng)的研究工作,從圓錐節(jié)叢胞(Arthrobotrysconoides)、囊孢單頂孢(Monacrosporiumcystosporium)、秀麗單頂孢(Monacrosporiumelegans)和小舟單頂孢(Monacrosporiummicroscaphoides)等捕食線蟲真菌中克隆到胞外絲氨酸蛋白酶基因,為進(jìn)一步研究捕食線蟲真菌侵染的分子機(jī)理提供了基因材料。2厚垣孢普可不同菌株對(duì)根結(jié)線蟲和胞囊線蟲生長(zhǎng)的作用內(nèi)寄生真菌和機(jī)會(huì)真菌通過寄生線蟲的卵、孢囊和游離線蟲并實(shí)現(xiàn)對(duì)線蟲的侵染,目前對(duì)內(nèi)寄生食線蟲真菌的胞外酶的研究主要集中在輪枝菌屬(Verticillium)、擬青霉屬(Paecilomyces)和被毛孢屬(Hirsutella)等屬的真菌,它們能夠分泌侵染相關(guān)的胞外絲氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶。薩克拉輪枝菌(Verticilliumsuchlasporium,syn.Pochoniasuchlasporia),是最先報(bào)道能分泌降解線蟲孢囊蛋白質(zhì)組分的內(nèi)寄生食線蟲真菌。Lopez-Llorca通過凝膠過濾和離子交換層析從薩克拉輪枝菌的發(fā)酵液中分離得到一個(gè)分子量為32kDa的蛋白酶(P32)。隨后,Lopez-Llorca和Robertson通過免疫化學(xué)的方法進(jìn)一步證實(shí)了P32在真菌穿透線蟲卵的過程中起作用。然而P32的編碼基因和相關(guān)的性質(zhì)沒有被進(jìn)一步地報(bào)道。Tikhonov等研究發(fā)現(xiàn),在以膠狀幾丁質(zhì)為主要碳源和氮源的培養(yǎng)基上,薩克拉輪枝菌和厚孢輪枝菌能夠產(chǎn)生一種分子量為43kDa幾丁質(zhì)酶(CHI43),CHI43能夠分解線蟲卵的幾丁質(zhì)表層。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),用P32和CHI43共同處理線蟲卵的分解效果要比它們單獨(dú)作用的分解效果好得多。厚垣孢普可尼亞菌也稱為厚孢輪枝菌(P.chlamydosporia,syn.Verticilliumchlamydosporium)能夠用于根結(jié)線蟲和胞囊線蟲的生物防治。Segers等在以大豆蛋白胨為唯一碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中純化得到一種分子量為33kDa的堿性絲氨酸蛋白酶(VCP1),VCP1對(duì)蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟化物(PMSF)和甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)高度敏感,能夠分解包括Azocoll等多種蛋白質(zhì)底物。同時(shí),VCP1能夠分解南方根結(jié)線蟲(M.incognita)卵殼的表層,并使幾丁質(zhì)層暴露出來。Morton等從不同線蟲宿主分離了6株厚垣孢普可尼亞菌,并從這些菌株中克隆得到侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的編碼cDNA序列,對(duì)這些來源不同的6個(gè)cDNA序列進(jìn)行同源性分析表明,厚垣孢普可尼亞菌的胞外絲氨酸蛋白酶非常保守,但是從胞囊線蟲和根結(jié)線蟲中分離得到的不同的厚垣孢普可尼亞菌,它們所產(chǎn)生的蛋白酶的氨基酸序列在65位和99位存在多態(tài)現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究表明從這兩種不同的線蟲宿主中分離的厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)生的蛋白酶對(duì)底物Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa和Succ-Ala-Val-Pro-Phe-pNa的分解能力也不相同,由此推測(cè)它們對(duì)S3結(jié)合區(qū)域的親和力不同。淡紫擬青霉能夠用于根結(jié)線蟲等植物寄生線蟲的防治。它能夠通過多種方式作用線蟲,既可以寄生線蟲的卵和孢囊,也可以產(chǎn)生具有殺線蟲作用的毒素。Bonants等用掃描電鏡觀察淡紫擬青霉對(duì)北方根結(jié)線蟲(M.hapla)卵的侵染過程發(fā)現(xiàn)有裂解酶的參與。從發(fā)酵液中得到的部分純化的蛋白酶的分子量為33.5kDa,最適反應(yīng)pH和溫度分別為10.3和60℃,蛋白酶的活性被PMSF完全抑制。通過延時(shí)顯微鏡(time-lapsemicroscopy)觀察發(fā)現(xiàn)純酶和線蟲卵一起孵化將嚴(yán)重影響卵的孵化,不成熟的卵更容易受到純酶的影響,然而純酶對(duì)幼蟲沒有明顯的影響,說明淡紫擬青霉產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶可能在線蟲卵的穿透過程中起作用。Khan等用透射電鏡觀察淡紫擬青霉產(chǎn)生的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶作用于爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)卵的過程,發(fā)現(xiàn)用蛋白酶和幾丁質(zhì)酶單獨(dú)或聯(lián)合處理都能夠改變卵殼的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過蛋白酶處理以后的線蟲卵,其脂質(zhì)層消失,幾丁質(zhì)層變薄;用幾丁質(zhì)酶處理的線蟲卵,其幾丁質(zhì)層中出現(xiàn)大的空泡,蛋黃層開裂并失去完整性。Khan等的研究進(jìn)一步表明,單獨(dú)或者聯(lián)合用淡紫擬青霉產(chǎn)生的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶處理根結(jié)線蟲的卵都能有效降低根結(jié)線蟲卵孵化成幼蟲,然而商品化的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶卻能夠增強(qiáng)孵化率。淡紫擬青霉還能分泌具殺線蟲活性的毒素類物質(zhì),Park等在淡紫擬青霉發(fā)酵液中檢測(cè)到白灰制菌素(Leucinostatin)的產(chǎn)生,并且具有殺線蟲活性。汪斌等從內(nèi)寄生真菌洛斯被毛孢(Hirsutellarhossiliensis)的發(fā)酵液中分離得到一種分子量為31kDa的絲氨酸蛋白酶,生物學(xué)測(cè)定表明它對(duì)大豆胞囊線蟲二齡幼蟲具有致死作用,該蛋白酶和其它內(nèi)寄生真菌的胞外絲氨酸蛋白酶具有較高的同源性。內(nèi)寄生食線蟲真菌能夠產(chǎn)生多種和侵染線蟲相關(guān)的胞外蛋白酶,具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)多種內(nèi)寄生食線蟲真菌的胞外酶的分泌和殺線蟲能力進(jìn)行了研究,目前已經(jīng)從刀孢輪枝菌(Lecanicilliumpsalliotae,syn.Verticilliumpsalliotae)和粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea,syn.Gliocladiumrosea)中分離得到高活性的胞外絲氨酸蛋白酶,為進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。3胞外絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的同源性綜上,食線蟲真菌在侵染過程中產(chǎn)生的胞外酶尤其是絲氨酸類的蛋白酶在它們對(duì)宿主線蟲的侵染或捕食中起著非常重要的作用,這些胞外絲氨酸蛋白酶的部分生化性質(zhì)歸納如下(表1)。食線蟲真菌產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶的分子量大小為30～40kDa左右,其中內(nèi)寄生食線蟲真菌的分子量非常接近(32～33.5kDa),它們都能夠被絲氨酸專一性蛋白酶抑制劑PMSF抑制,并且內(nèi)寄生食線蟲真菌來源的蛋白酶的等電點(diǎn)或最適pH值要高于捕食線蟲真菌來源的蛋白酶。盡管食線蟲真菌產(chǎn)生的胞外侵染性絲氨酸蛋白酶有很多共性,但分別從捕食線蟲真菌和內(nèi)寄生真菌分離的蛋白酶的生化性質(zhì)還是有一定的差別(表1)。食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性分析(圖1)表明,捕食線蟲真菌和內(nèi)寄生真菌產(chǎn)生的蛋白酶的同源性較低(38%),不同屬的捕食線蟲真菌產(chǎn)生的蛋白酶的同源性較高(>53%),而內(nèi)寄生食線蟲真菌來源的蛋白酶和寄生金龜子等昆蟲的綠僵菌和球孢白僵菌的胞外絲氨酸蛋白酶具有較高的同源性(>57%)。由此,食線蟲真菌產(chǎn)生的侵染性胞外絲氨酸蛋白酶生化性質(zhì)的差異和它們的氨基酸的差異相互聯(lián)系的。4食線蟲真菌胞外絲氨酸蛋白酶的擴(kuò)增和同源性目前用于防治植物寄生線蟲的主要手段包括化學(xué)殺線蟲劑、作物輪作和線蟲的抗性品種篩選等,但現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求使化學(xué)殺線蟲劑的使用受到限制,農(nóng)作物抗線蟲品種目前也缺乏,所以線蟲的生防制劑的開發(fā)和規(guī)?；瘧?yīng)用將成為必然的趨勢(shì)?，F(xiàn)在人們對(duì)于食線蟲真菌侵染的分子機(jī)制了解較少,只有少數(shù)幾種真菌的胞外酶被純化和相關(guān)基因得到克隆,這對(duì)于我們了解食線蟲真菌的侵染和捕食的分子機(jī)制及應(yīng)用是不夠的。目前食線蟲真菌胞外酶基因的克隆還在沿用傳統(tǒng)的方法和手段,即通過對(duì)胞外蛋白酶分離純化,根據(jù)它的N-端氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物或探針,通過RACE技術(shù)或cDNA文庫篩選得到蛋白酶的全長(zhǎng)基因序列。我們的研究表明食線蟲真菌產(chǎn)生的侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的同源性非常高,可以根據(jù)已知食線蟲真菌蛋白酶的同源性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,直接擴(kuò)增得到不同來源不同種屬的侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的編碼基因,這將極大地加快對(duì)食線蟲真菌的侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的研究,并為食線蟲真菌侵染分子機(jī)制的研究提供良好的實(shí)驗(yàn)材料。綜上所述,食線蟲真菌所產(chǎn)生的胞外絲氨酸蛋白酶在它們侵染植物寄生線蟲的過程中起著非常重要的作用,它們不僅能夠分解線蟲的孢囊和線蟲表皮,也能夠直接殺死線蟲,所以增強(qiáng)食線蟲真菌產(chǎn)生胞外絲氨酸蛋白酶的能力是提高生防制劑防效的關(guān)鍵和途徑之一。除了在自然土壤中篩選胞外絲氨酸蛋白酶的活力更高的食線蟲真菌之外,可以通過以下兩種方法來提高食線