黃連解毒湯對(duì)小鼠腸道菌群的影響

黃連解毒湯對(duì)小鼠腸道菌群的影響

在人體的體表和身體腔中發(fā)現(xiàn)了許多不受影響的微生物，尤其是腸道中存在各種微生物，這些微生物被統(tǒng)稱(chēng)為腸道菌群。這些微生物群對(duì)其宿主非但無(wú)害，而且有益，并有眾多的生理效應(yīng)，這是正常微生物群與其宿主長(zhǎng)期共生的進(jìn)化結(jié)果。一般情況下，腸道菌群與人體和外部環(huán)境保持著一個(gè)平衡狀態(tài)，對(duì)人體的健康起著重要作用。很多文獻(xiàn)均已證明過(guò)量使用抗生素將造成人體腸道菌群失調(diào)，造成二次感染，威脅人類(lèi)生命。根據(jù)中醫(yī)理論，過(guò)量或長(zhǎng)期服用苦寒的清熱解毒中藥將損傷脾胃、耗傷正氣，也有報(bào)道部分苦寒中藥例如黃連解毒湯等在體外有抑菌殺菌作用，而如果濫用苦寒中藥是否有類(lèi)似于抗生素的破壞作用還未見(jiàn)報(bào)道。而傳統(tǒng)上中草藥的使用，絕大多數(shù)以方劑的形式通過(guò)口服吸收而發(fā)揮作用，藥物中的有效成分在進(jìn)入腸道之后不可避免地與腸道菌群發(fā)生關(guān)聯(lián)，故對(duì)于中藥，體外實(shí)驗(yàn)并不能完全代替體內(nèi)的研究。本研究建立了抗生素引起的菌群失調(diào)模型和不同劑量的黃連解毒湯灌胃模型，與正常小鼠進(jìn)行比較，嘗試在小鼠體內(nèi)通過(guò)觀察腸道菌群變化來(lái)研究黃連解毒湯對(duì)小鼠的影響，以期為臨床合理使用清熱解毒中藥提供參考資料。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物昆明種小鼠，由中山大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～22g，雌雄不限。1.1.2麻黃溶解湯鹽酸林可霉素注射液為天方藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；黃連解毒湯（黃連、黃岑、黃柏、梔子）由中山一院藥房提供，常規(guī)煎制，濃縮至1g/mL生藥量，4℃保持備用。1.1.3培養(yǎng)基MRSA培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司出品。1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器和方法YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器、潔凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FA2004N電子天平、PV-1漩渦混勻器、金花加樣器、PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、825-A型厭氧菌培養(yǎng)罐、BX51型熒光明場(chǎng)數(shù)碼顯微鏡均由中山大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供。1.2方法1.2.1實(shí)行藥物急性毒性昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為正常組、抗生素組、黃連解毒湯高劑量組、黃連解毒湯低劑量組4組，每組10只?？股亟M給予鹽酸林可霉素灌胃，每日每只60mg；黃連解毒湯高劑量組給予黃連解毒湯灌胃，每日每只0.15g；黃連解毒湯低劑量組給予黃連解毒湯灌胃，每日每只0.075g；正常組給予生理鹽水灌胃，每日每只0.6ml。各組均灌胃14d。1.2.2行為觀察每天觀察和記錄各組小鼠外形、活動(dòng)、飲食、排便情況，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第1天、第7天、第14天稱(chēng)量和記錄小鼠體重。1.2.3巴結(jié)及胰腺的制備脫頸椎處死小鼠，解剖后無(wú)菌取小鼠淋巴結(jié)、脾臟，淋巴結(jié)及脾臟放入無(wú)菌玻璃研磨器內(nèi)，加入等體積無(wú)菌生理鹽水，充分研磨后稀釋10倍，取100μl，涂于BHI培養(yǎng)基上，37℃有氧條件下培養(yǎng)24h后觀察。1.2.4cfu/g標(biāo)本將小鼠斷椎處死，常規(guī)消毒后正中剪開(kāi)腹腔，找出回盲部，無(wú)菌條件取出盲腸內(nèi)容物涂于潔凈玻片上，革蘭染色后鏡檢計(jì)數(shù)球菌和桿菌的比例，另取盲腸內(nèi)容物0.1g，置于裝有玻璃珠的無(wú)菌試管內(nèi)，加0.9ml生理鹽水，于震蕩器上震蕩15min，使盲腸內(nèi)容物均質(zhì)化。將上述震蕩好的標(biāo)本進(jìn)行10倍系列稀釋至106。選用104、105、106的稀釋度，以滅菌吸頭，自高稀釋度向低稀釋度在相應(yīng)的培養(yǎng)基上各滴加50μl稀釋液，待滴種好的培養(yǎng)基吸干后，放入37℃溫箱中培養(yǎng)。其中MRSA培養(yǎng)基（分離乳酸桿菌）厭氧培養(yǎng)48h,BS培養(yǎng)基（分離雙歧桿菌）厭氧培養(yǎng)72h、腸球菌瓊脂（分離腸球菌）需氧培養(yǎng)24h、麥康凱培養(yǎng)基（分離腸桿菌）需氧培養(yǎng)24h。待菌落長(zhǎng)出后，以菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)鑒定所需目的菌。培養(yǎng)好的細(xì)菌經(jīng)鑒定后計(jì)算每克盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量，即CFU/g標(biāo)本。選擇菌落適中的稀釋度，算出同一稀釋度平均菌落數(shù)（X）。公式：CFU/g標(biāo)本=X/0.05×稀釋倍數(shù)×1/標(biāo)本重量（g）。結(jié)果用常用對(duì)數(shù)值lgCFU/g表示。2結(jié)果2.1高劑量又成反應(yīng)時(shí)小鼠攝食量和體重變化情況正常組小鼠飲食正常，行動(dòng)活躍，被毛平整光滑，糞便正常。抗生素組小鼠攝食量下降，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，被毛無(wú)光澤，畏寒扎堆，大便稀濕。高劑量組小鼠攝食量亦下降，行動(dòng)較遲緩，被毛無(wú)光澤，大便稀濕。低劑量組小鼠飲食正常，行動(dòng)活躍，被毛平整光滑，糞便正常。正常組小鼠體重增加，抗生素組體重下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組體重明顯下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低劑量組體重上升，與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。2.2小鼠細(xì)菌位移的比較正常組未見(jiàn)細(xì)菌移位?？股亟M細(xì)菌移位現(xiàn)象比其它組明顯，有50%的小鼠共5例出現(xiàn)細(xì)菌移位現(xiàn)象，分別是移至腸系淋巴結(jié)4例，移至脾臟1例；高劑量組有2例，均是移至腸系淋巴結(jié)；低劑量組未見(jiàn)細(xì)菌移位。2.3抗生素對(duì)腸球形菌群的影響據(jù)劉勇報(bào)道，臨床對(duì)腸道菌群狀況分析以球菌與桿菌比例的方式報(bào)告，簡(jiǎn)稱(chēng)球菌桿菌比，參考值為1∶3（成人）。如結(jié)果在參考范圍內(nèi)，則表明菌群正常，如果球菌桿菌比大于1/3，表明菌群失調(diào)，比值越大，失調(diào)越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠盲腸內(nèi)容物球菌桿菌比鏡下統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，正常組腸道菌群球菌桿菌比為1/15即小于1/3，其菌群組成正常?？股亟M菌群球菌桿菌比大于1/3，提示其菌群失調(diào)，抗生素組模型構(gòu)建成功。高劑量組球菌桿菌比為2/5，大于1/3，亦屬菌群失調(diào)，但其比例小于抗生素組，失調(diào)情況不及抗生素組嚴(yán)重。低劑量組球菌桿菌比小于1/3，即菌群組成正常。目的菌培養(yǎng)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，與正常組比較，抗生素組和高劑量組的乳酸桿菌均顯著減少，低劑量組與正常組之間數(shù)量接近，抗生素組和高劑量組之間無(wú)差異；各組的雙歧桿菌的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與乳酸桿菌的情況類(lèi)似；各組的腸球菌兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），抗生素組的條件致病菌腸球菌顯著增加，高劑量組的腸球菌亦增加，而低劑量組的腸球菌低于正常組?？股亟M和高劑量組的大腸埃希菌數(shù)量均高于正常組的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組的大腸埃希菌比正常組少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3抗生素對(duì)小鼠腸道菌群的影響《內(nèi)經(jīng)·靈樞·邪客》說(shuō)：“人與天地相應(yīng)也”。不但人體本身是一個(gè)有機(jī)的整體，人體的各種功能互相協(xié)調(diào)、彼此為用，而且人和環(huán)境之間也是互相影響的，是一對(duì)不可分割的整體，當(dāng)自然環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，人體也會(huì)發(fā)生與之相應(yīng)的變化，即“天人相應(yīng)”的思想。微生態(tài)學(xué)也認(rèn)為一切生物都是環(huán)境的對(duì)立統(tǒng)一體。在微生態(tài)的研究中，可以運(yùn)用中醫(yī)天人相應(yīng)的整體觀作為指導(dǎo)思想，就是要處處注意調(diào)節(jié)人體與微生物之間內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，以及人體（包括微生物群）與外環(huán)境的平衡。微生態(tài)學(xué)認(rèn)為微生態(tài)失調(diào)是微生物致病的本質(zhì)。微生態(tài)失調(diào)時(shí)系統(tǒng)由相似于中醫(yī)的正氣（平衡）向邪氣（失平衡）轉(zhuǎn)化，其所產(chǎn)生的病理作用可表現(xiàn)為菌群失調(diào)、菌群易位或外籍菌入侵。如感染性疾病，由于長(zhǎng)期、大劑量使用抗生素，在控制感染的同時(shí)，也大量殺傷原籍菌，造成菌群失調(diào)，破壞了定植抗力，而使耐藥性的細(xì)菌定植繁殖，形成新的二重感染。觀察本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的外觀、體重變化曲線可見(jiàn)，與正常組小鼠比較，抗生素組小鼠在實(shí)驗(yàn)后期明顯出現(xiàn)食欲不振、體重下降、被毛無(wú)光、活動(dòng)減少、大便稀濕等現(xiàn)象，高劑量組也有類(lèi)似情況出現(xiàn)?？股靥幚砗竽c系淋巴結(jié)或脾臟細(xì)菌移位現(xiàn)象比其它組明顯，而高劑量組亦有2例移位現(xiàn)象。另外，腸道菌群比較分析顯示，正常組菌群比例正常，抗生素組小鼠腸道菌群球菌桿菌比大于1/3，出現(xiàn)菌群失調(diào)，雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌數(shù)量下降。高劑量組與正常組比較，其雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量亦有顯著差異，且球菌桿菌比大于1/3，已出現(xiàn)菌群失調(diào)?？梢?jiàn)腸道菌群變化，與宿主的精神狀態(tài)、食欲、體重等狀態(tài)的變化有相關(guān)性。體現(xiàn)為腸道菌群正常，個(gè)體的狀態(tài)良好；腸道菌群失調(diào)，個(gè)體的狀態(tài)變差?？股亟M小鼠的盲腸內(nèi)容物涂片鏡檢可見(jiàn)球菌桿菌比大于1/3，達(dá)到臨床上菌群失調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)，另外細(xì)菌移位也顯著高于正常組，說(shuō)明抗生素引起的菌群失調(diào)模型已經(jīng)構(gòu)建成功。其對(duì)機(jī)體有益的雙歧桿菌和乳酸桿菌大量減少，條件致病的腸球菌異常增多，與正常組有顯著差異。腸道微生態(tài)平衡是腸黏膜發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。在這種微生態(tài)失調(diào)的情況下，機(jī)體的定植抗力下降，使外襲菌容易入侵定植或條件致病菌過(guò)量增殖移位而引起感染。高劑量組的各種目的菌也有類(lèi)似的情況，雙歧桿菌和乳酸桿菌與正常組比較明顯減少，腸球菌增多情況雖不及抗生素組增加的幅度，但也與正常組有差異，且涂片鏡檢可見(jiàn)球菌桿菌比大于1/3，結(jié)合細(xì)菌移位情況，提示我們高劑量組與