分子技術(shù)在杉木遺傳育種中的應(yīng)用

分子技術(shù)在杉木遺傳育種中的應(yīng)用

楠木是馬鞭草科的一種大型樹木。它自然分布在巴基斯坦南926和東經(jīng)7314的印度南部、中部、泰國(guó)北部、緬甸和老撾。它是世界上最著名的材料樹種，被稱為“萬(wàn)木之王”。心材呈黃色或深褐色，質(zhì)地堅(jiān)硬持久，結(jié)構(gòu)致密美觀，無(wú)變形和開裂。它是制作軍艦、船只、碼頭、橋梁、建筑、客車、家具、雕塑和木材的優(yōu)質(zhì)材料。柚木在珍貴樹種中屬速生樹種,具有生長(zhǎng)快、材質(zhì)優(yōu)良、用途廣以及投資回報(bào)率高等特點(diǎn),在熱帶、南亞熱帶地區(qū)廣為種植,是世界上人工林種植面積最大的4個(gè)樹種之一,也是單位面積產(chǎn)值最高的造林樹種。柚木引進(jìn)我國(guó)栽培已有180多年歷史,現(xiàn)在推廣種植范圍遍及10個(gè)省(自治區(qū))60多個(gè)縣(市),總面積約1.5萬(wàn)hm2,20世紀(jì)70年代初我國(guó)開始了柚木遺傳育種和栽培技術(shù)的系統(tǒng)研究[6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]。目前,開展柚木研究的國(guó)家主要有印度、泰國(guó)和中國(guó)等,國(guó)外在種源選擇、優(yōu)樹選擇與測(cè)定、無(wú)性繁殖技術(shù)、無(wú)性系變異與育種、材性等方面開展了系統(tǒng)的研究。在常規(guī)育種方面[6,7,8,9,10,11,12,13],我國(guó)已達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平,但在分子育種方面,我國(guó)起步較晚,2007年才見有柚木分子生物學(xué)研究的報(bào)道。自1995年Kertadikara等首次報(bào)道柚木分子生物學(xué)研究以來,柚木分子育種和常規(guī)育種即緊密結(jié)合,相輔相成,推動(dòng)了柚木育種工作的進(jìn)程。分子生物學(xué)理論和技術(shù)在柚木遺傳育種研究中的應(yīng)用,一方面使我們更加清晰地認(rèn)識(shí)了柚木種質(zhì)資源的遺傳特性,提高了現(xiàn)有資源的利用效率,為新的柚木資源的收集提供了科學(xué)依據(jù),確保了柚木育種工作的可持續(xù)性發(fā)展;另一方面,為柚木育種提供了新方法,縮短了育種周期,加速了柚木遺傳改良的進(jìn)程,提高了柚木抗逆性?？v觀國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),應(yīng)用于柚木遺傳育種研究的分子生物技術(shù)包括了同功酶、分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因等技術(shù),內(nèi)容涉及了遺傳變異與遺傳多樣性、種源鑒定、優(yōu)樹和無(wú)性系鑒定、分子標(biāo)記輔助選擇育種、抗蟲育種和基因克隆等方面。文章對(duì)柚木分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)行了總結(jié)和歸納,并分析討論目前我國(guó)柚木遺傳育種研究存在的瓶頸問題,針對(duì)性地提出了我國(guó)柚木分子生物學(xué)研究的迫切性和研究方向,對(duì)我國(guó)柚木分子生物學(xué)的深入研究起到積極地促進(jìn)作用。1關(guān)于杉木分子遺傳繁殖的科學(xué)研究1.1形態(tài)遺傳多樣性一個(gè)樹種遺傳變異的大小決定了其對(duì)生存環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)能力,而遺傳變異研究是對(duì)其進(jìn)行改良利用的重要前提。分子標(biāo)記是評(píng)價(jià)樹種群體內(nèi)和群體間遺傳變異的有利工具。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來看,各國(guó)柚木研究人員都十分注重種質(zhì)資源分子遺傳變異的基礎(chǔ)研究,已報(bào)道了柚木同功酶、RAPD、AFLP、SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)研究。柚木天然分布范圍廣,各分布區(qū)不連續(xù),或雖連續(xù)但分布區(qū)內(nèi)海拔、降雨、地形等生態(tài)地理?xiàng)l件差異大,使得柚木具有豐富的遺傳變異。Nicodemus等采用RAPD技術(shù)分析了印度10個(gè)柚木天然種群,得出種的遺傳多樣性為0.3,種群內(nèi)基因多樣度為0.185~0.261(平均為0.233)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)柚木種群內(nèi)遺傳多樣性與緯度呈負(fù)相關(guān)性,印度南部種群遺傳多樣性高于中部種群。根據(jù)研究結(jié)果,印度南部和印度中部地區(qū)應(yīng)看作兩個(gè)獨(dú)立的柚木分布地理區(qū)域,并加強(qiáng)兩地種群的就地保存。眾多研究表明,柚木各天然分布區(qū)中,印度群體與其它分布國(guó)的群體遺傳差異明顯,且是柚木遺傳多樣性中心。Fofana等進(jìn)一步分析顯示,各天然分布區(qū)的柚木資源分別聚成4個(gè)類群,其中2個(gè)聚群都為印度群體,是柚木遺傳多樣性中心;第3個(gè)聚群由泰國(guó)和老撾的群體組成,它們和印度群體遺傳差異明顯,但只有一半的等位基因發(fā)生變異;第4聚群來自老撾中部,遺傳變異最少。柚木地理分布區(qū)的不連續(xù)和生態(tài)差異,也使得柚木種群間遺傳差異明顯,種群間遺傳分化大,因此,失去哪個(gè)種群都將丟失柚木的遺傳變異。另外,柚木的遺傳變異規(guī)律存在一定的地理模式,種源間的遺傳距離和地理分布距離相關(guān),地理距離近的種源間遺傳關(guān)系近,不同的種源按地理距離分別聚成一類[20,21,23,25,26,27,30]。Ansari用ISSR標(biāo)記分析柚木種群顯示,群體內(nèi)遺傳多樣性占91%,群體間占6.17%,不同生態(tài)區(qū)域間占2.77%。而Nicodemus等采用RAPD技術(shù)分析得出柚木種群內(nèi)遺傳多樣性占78%。從多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道來看,研究者采用了不同的分子標(biāo)記方法,分析的具體柚木材料也有不同,得出的結(jié)果會(huì)有所差異,不能進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較。但研究一致顯示柚木遺傳變異主要存在于群體內(nèi),應(yīng)注重種群內(nèi)選擇以獲得更大的遺傳基礎(chǔ),可加強(qiáng)柚木優(yōu)樹的選擇來開展育種工作。柚木在世界熱帶、南亞熱帶地區(qū)的引種歷史悠久,Kjaer和Fofana等分別發(fā)現(xiàn),有的人工群體可能由于種源間雜交其遺傳變異也較高,甚至高于天然群體;有的柚木非天然群體和天然群體遺傳多樣性相近,可見一些早期人工林或次生林引種后在新環(huán)境條件的影響下,產(chǎn)生了新的遺傳變異,亦或是所引種的材料來自多個(gè)天然群體,使得這些人工林也有較廣的遺傳基礎(chǔ),這有利于遺傳資源的保存,也拓寬了柚木育種材料的選擇范圍。1.2國(guó)外研究現(xiàn)狀柚木引種已有300多年的歷史,現(xiàn)在遍布世界熱帶及南亞熱帶地區(qū),已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其天然分布區(qū),很多國(guó)家或地區(qū)早期引種的柚木資源來源不清,改良利用具有一定的盲目性,存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性。在林木育種過程中,當(dāng)遇到優(yōu)良材料或育種材料不清楚的時(shí)候,在掌握全分布區(qū)或充分資源的情況下,可通過遺傳標(biāo)記分析資源間的親緣關(guān)系或遺傳距離來進(jìn)行來源譜系鑒定,為育種提供明確的親本或清晰的材料路線,根據(jù)育種目標(biāo)選擇出最佳育種親本或育種材料,在營(yíng)建高效雜交種子園時(shí)更好地選擇建園材料和合理地進(jìn)行配置,充分利用譜系清楚、優(yōu)勢(shì)明顯和親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)資源進(jìn)行雜交,從而創(chuàng)制出具雜種優(yōu)勢(shì)的柚木新種質(zhì)。柚木種源遺傳變異和親緣關(guān)系研究表明,聚類分析能很好的展現(xiàn)地理格局或遺傳關(guān)系,可以對(duì)柚木引種材料追根溯源,這為柚木種源的地理來源鑒定提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。Verhaegen等用SSR分析比較了22個(gè)印度尼西亞和非洲的柚木種源和17個(gè)柚木天然種源,發(fā)現(xiàn)貝寧、喀麥隆、科特迪瓦、坦桑尼亞、多哥和塞內(nèi)加爾的柚木種源有近95%來自印度北部,印度尼西亞和加納柚木種源有96%來自老撾中部,這和國(guó)際柚木種源試驗(yàn)研究所得的結(jié)果一致;Fofana等分析了科特迪瓦引種的柚木種源和天然種源的遺傳關(guān)系,結(jié)果顯示,柚木種源聚成3類,非洲的柚木種源和印度北部的遺傳關(guān)系最近,但是有一個(gè)種源和泰國(guó)種源遺傳關(guān)系更接近;Shrestha等采用AFLP技術(shù)分析了印度、泰國(guó)和印度尼西亞的9個(gè)柚木天然群體,聚類分析表明,印度尼西亞種群應(yīng)該來自泰國(guó)種群,但印度奧里薩邦(印度東北部海岸附近)的柏培拉種群與泰國(guó)種群和印度尼西亞種群聚在一起。1.3研究推廣改性措施前人研究結(jié)果顯示,柚木遺傳變異主要存在于群體內(nèi),應(yīng)注重種群內(nèi)選擇以獲得更大的遺傳基礎(chǔ),柚木優(yōu)樹選擇和子代測(cè)定可作為開展柚木育種工作的有效途徑之一。在進(jìn)行柚木優(yōu)樹優(yōu)擇時(shí),利用分子標(biāo)記輔助選擇育種,可以大大縮短選育時(shí)間,提高資源選育利用效率。目前,已有采用同功酶、RAPD、ISSR和SCAR分子標(biāo)記技術(shù)選擇柚木優(yōu)樹和進(jìn)行柚木無(wú)性系鑒定的報(bào)道,研究人員通過對(duì)不同優(yōu)樹或無(wú)性系材料擴(kuò)增出的特異性標(biāo)記或部分材料的共有標(biāo)記,快速準(zhǔn)確地選擇出了一批優(yōu)樹和無(wú)性系,經(jīng)大田測(cè)試后,選擇效果較好;最后,利用這些多態(tài)性標(biāo)記,還建立了各無(wú)性系的指紋圖譜,用于無(wú)性系分株的鑒定。在柚木無(wú)性系多代繁殖變異方面,Gangopadhyay等用RAPD技術(shù)研究了微繁殖不同代數(shù)的柚木無(wú)性系的遺傳一致度,在第5,10,15和20代中依然沒有檢測(cè)到與母株不同的變異,在第25代中檢測(cè)到1株產(chǎn)生了變異?？梢?柚木無(wú)性系后代遺傳穩(wěn)定性好,一致度高。1.4用組織化學(xué)和基因法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)引病蟲害是導(dǎo)致柚木減產(chǎn)的主要原因之一,據(jù)馬來西亞研究者統(tǒng)計(jì),柚木蟲害達(dá)22種之多,其中對(duì)柚木生長(zhǎng)危害最嚴(yán)重的食葉害蟲是柚木弄蛾(Hyblaeapuera),使尼倫布爾柚木林的木材量減少44%,引起了各國(guó)柚木研究者的高度重視。噴生物殺蟲劑控制病蟲害覆蓋面有限,只能解決小規(guī)模病蟲害的問題。而通過基因工程,將抗蟲基因?qū)﹁帜静牧线M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,可創(chuàng)造抗病蟲害的柚木新品種,是解決該問題的有效途徑。國(guó)外已經(jīng)建立了成熟的柚木再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。Widiyanto等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GUS基因?qū)腓帜灸垩拷M織,組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明,不同的無(wú)性系轉(zhuǎn)化率差別較大,無(wú)性系P108達(dá)到94.6%,而P20只有38.9%;GUS表達(dá)最強(qiáng)的組織是葉片和節(jié)間組織,其次是頂芽的幼嫩組織。Norwati等以柚木帶節(jié)莖段(nodalsegment)為外植體,建立了柚木遺傳轉(zhuǎn)化體系,采用基因槍法進(jìn)行了柚木轉(zhuǎn)抗蟲cry1A(b)基因、β-glucuronidase(uidA)基因和Bt基因的遺傳轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)化后在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)3個(gè)星期,然后轉(zhuǎn)移到含有10μg/mL潮酶素(hygromycin)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,2次篩選后重新接種到MS培養(yǎng)基;通過對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行GUS檢測(cè)、PCR分析、Southern雜交和RT-PCR檢測(cè),證明外源基因成功轉(zhuǎn)化整合到受體植株中;喂蟲試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因植株葉片抗蟲效果顯著。1.5對(duì)材料中l(wèi)hi同簇基因的檢測(cè)基因克隆和功能鑒定可研究控制樹木生長(zhǎng)性狀的分子機(jī)理、進(jìn)行數(shù)量性狀基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇育種,最終有望實(shí)現(xiàn)分子設(shè)計(jì)遺傳改良。Norlia等在2008年克隆了控制柚木開花的LHY同簇基因,命名為(Tg-LHY),該基因cDNA全長(zhǎng)為2948bp,編碼768種氨基酸,保守區(qū)是MYB蛋白,是植物生物鐘循環(huán)系統(tǒng)中起負(fù)反饋響應(yīng)的DNA綁定蛋白,該基因在天亮開花4h后表達(dá)水平高。該研究對(duì)柚木開花樹齡和花期調(diào)控以及種子園豐產(chǎn)技術(shù)有重大意義。2中國(guó)木條玉的遺傳育種問題和建議2.1優(yōu)良群落的引進(jìn)和利用100多年來我國(guó)已引進(jìn)、收集和保存了柚木種源102個(gè),包括天然種源30個(gè),國(guó)內(nèi)次生種源72個(gè),這些種質(zhì)資源是我國(guó)柚木育種的基礎(chǔ)材料。早期數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)研究人員、商人和華僑早期(1840—1965年)通過各種途徑引進(jìn)的柚木種源中,有部分種源在適應(yīng)性、生長(zhǎng)和抗性方面表現(xiàn)優(yōu)良,其種子常被當(dāng)?shù)厝藗儾墒沼糜谌斯ち纸ㄔO(shè)。為了加速柚木推廣利用進(jìn)程和擴(kuò)大育種資源儲(chǔ)備,對(duì)一些稀少的優(yōu)良資源有必要從其天然群體中增加引種。遺憾的是,國(guó)內(nèi)部分優(yōu)良次生種源的來源信息沒有檔案記錄,一直以來都給柚木種質(zhì)資源收集和創(chuàng)新利用造成困擾。因此,根據(jù)前人研究結(jié)果,可采用分子標(biāo)記技術(shù),開展國(guó)內(nèi)優(yōu)良次生種源的地理來源鑒定研究,為柚木種質(zhì)資源收集和育種親本的選擇提供科學(xué)指導(dǎo),具有極為重要的科學(xué)意義和實(shí)踐意義。2.2dna的檢測(cè)遺傳變異是育種的前提,研究人員需要熟悉掌握柚木種質(zhì)資源的遺傳變異水平、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。有關(guān)這方面的研究可從表型、細(xì)胞、生理和分子4個(gè)水平上的遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析,而以分子水平上直接檢測(cè)遺傳物質(zhì)DNA效率最高,準(zhǔn)確可靠。我國(guó)主要在生長(zhǎng)表型上研究柚木的遺傳變異,且測(cè)試時(shí)間長(zhǎng),受環(huán)境因素影響大。因此,迫切需要從DNA分子水平系統(tǒng)研究我國(guó)柚木種質(zhì)資源遺傳變異和親緣關(guān)系,挖掘特異性種質(zhì)資源,評(píng)估其遺傳改良潛力,以便高效利用所掌握的資源進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新,開展柚木遺傳改良工作。2.3選育優(yōu)良新品系作為一個(gè)外來引進(jìn)樹種,柚木在我國(guó)熱帶和南亞熱帶的發(fā)展主要受到酸性土壤和極端低溫氣候的限制,因此,如何盡快選育出更加高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗的柚木優(yōu)良新品系,是大力發(fā)展柚木種植業(yè)面臨的一個(gè)迫切需要解決的現(xiàn)實(shí)問題。通過基因工程創(chuàng)造柚木高抗新材料、新種質(zhì)和新品種,可大大縮短育種周期,是解決該問題的有效途徑。目前,根據(jù)我國(guó)柚木發(fā)展的主要限制因素,宜進(jìn)行柚木轉(zhuǎn)基因抗寒和耐酸性土壤的新品種選育研究,通過將抗寒和耐酸性土壤基因?qū)腓帜緹o(wú)性系,提高柚木優(yōu)良無(wú)性系的抗逆性,從而擴(kuò)大栽培區(qū)域,適應(yīng)我國(guó)柚木生產(chǎn)發(fā)展的需要。當(dāng)前,國(guó)內(nèi)正在開展這方面的研究。2.4環(huán)保節(jié)能材料的分子檢測(cè)根據(jù)前人研究結(jié)果,今后應(yīng)更加注重柚木的優(yōu)樹選擇,然后進(jìn)行子代測(cè)定,對(duì)子代表現(xiàn)優(yōu)良的無(wú)性系進(jìn)行無(wú)性繁殖和推廣利用。我國(guó)40多年來經(jīng)過大量的田間測(cè)試,已經(jīng)篩選出了一些速生、抗寒、抗風(fēng)、抗病和材質(zhì)優(yōu)良