苦蕎提取物對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

苦蕎提取物對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

2型糖尿?。╰2dm）是一種常見的臨床疾病，伴有胰島細(xì)胞的損傷和胰阻力。在我國發(fā)病率逐漸增加,目前已經(jīng)達(dá)到2.6%,并以每年100萬的速度遞增。有文獻(xiàn)報道,其發(fā)病機(jī)制與胰島β細(xì)胞部分凋亡導(dǎo)致功能不足有關(guān)?？嗍w[Fagopyrumtataricum(linn)Gaertn]富含生物類黃酮(Flavonoid)、糖醇(Fagopytitol)、D-手性肌醇(D-chirolnositol)、花青素(Anthoeyanidin)等成分。這些成分能有效改善胰島功能、調(diào)節(jié)血糖、血脂從而產(chǎn)生降糖作用。本研究探討苦蕎提取物對T2DM大鼠胰島β細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用,從而為苦蕎在臨床上抗糖尿病的應(yīng)用提供參考。報道如下。1材料和方法1.1細(xì)胞凋亡ssRM2265全自動旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)、1220烘片機(jī)、TP1020脫水機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司);ALC-210.3型電子分析天平(AC-CULAB,上海);顯微鏡系統(tǒng)(日本,NikonEclipseTi),OneTouchUltra穩(wěn)豪型血糖儀(美國強(qiáng)生)。Caspase-3兔抗大鼠抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司,MK1020);STZ(美國Sigma公司);高糖飲用水(12%果糖水:120g果糖溶于1000ml蒸餾水中);胰島素測定試劑盒(FINS,北京北化康泰臨床試劑有限公司,產(chǎn)品批號:20121112)?？嗍w提取物(苦蕎黃酮70%,西安塞納生物技術(shù)有限公司);鹽酸二甲雙胍片(北京中惠藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號:20120504)。1.2給藥及飼養(yǎng)條件雄性Spraguse-Dawley(SD)健康大鼠60只,體質(zhì)量180～220g,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。60只大鼠隨機(jī)分為6組:正常對照組（control)、模型組(model)、苦蕎提取物低(kq-1)、中(kq-2)、高(kq-3)劑量組以及二甲雙胍組,每組10只。其中模型組和給藥組均每天給予高糖飲用水以及高脂飼料喂養(yǎng):飼養(yǎng)條件為:飼養(yǎng)于48cm×35cm×24cm的鼠籠中;12h交替照明(從早上7時開始照明),室溫保持在(25±1)℃,相對濕度為60%～70%,所有的動物實(shí)驗(yàn)和處理均遵照“theGuidelinesfortheCareandUseofLaboratoryAnimals”。1.3苦蕎提取物對大鼠的造模雄性SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后,先采用高脂高糖誘導(dǎo)大鼠2周,隨后一次性腹腔注射STZ(30mg·kg-1)聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠建立2型糖尿病動物模型。造模成功后,給藥組分別每天給予苦蕎提取物低、中、高劑量組大鼠灌胃苦蕎提取物,劑量分別為:250mg·kg-1、500mg·kg-1、1g·kg-1,二甲雙胍組給予劑量為300mg·kg-1。正常對照組和模型組給予等劑量的生理鹽水灌胃。1.4大鼠血糖和血清胰島素水平造模后檢測各組大鼠空腹血糖;給藥4周后,檢測大鼠空腹血糖值和血清胰島素(EINS)值。采用血糖儀測定其血糖。采用放射免疫法測定EINS水平,檢測方法依據(jù)試劑盒說明書。1.5大鼠胰腺組織的重建給藥4周后,大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉(10ml·kg-1)麻醉,隨后頸椎脫臼處死大鼠,解剖取其胰臟,迅速放入冰冷的生理鹽水中漂洗,并用濾紙吸收水分,隨后用紗布包裹組織并放入10%福爾馬林固定24h。1.6病理組織學(xué)檢查對所取胰臟組織常規(guī)進(jìn)行10%福爾馬林固定24h后,用流水沖洗2h,然后梯度乙醇、常規(guī)石蠟包埋,包埋后的組織切成4μm厚的標(biāo)本,經(jīng)蘇木精-伊紅(H&E)染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。另外,切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇、0.3%H2O2以及5%BSA封閉液處理后,加入一抗caspase-3,隨后保濕盒4℃過夜,PBS水洗3次后,加入二抗,DAB顯色,日本NikonEclipseTi顯微鏡系統(tǒng)鏡下檢測拍照1.7抗起毛劑免疫本研究大鼠胰臟組織切片先經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇、(0.01mol·L-1PBS清洗3次后每個切片滴加新鮮稀釋的ProteinaseK37℃消化15min,隨后加入標(biāo)記緩沖液37℃標(biāo)記2h,經(jīng)過0.01mol·L-1TBS清洗3次后,滴加封閉液,30min后加入生物素化抗地高辛抗體,隨后加入SABC,37℃反應(yīng)30min后,0.01mol·L-1TBS清洗5次后,DAB顯色。具體方法參照武漢博士德生物技術(shù)有限公司說明書。2結(jié)果2.1各組大鼠空腹血糖的比較采用高脂飲食聯(lián)合STZ造模后,各造模組空腹血糖水平均明顯升高,與對照組比較,差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),給藥組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。給藥4周后,各給藥組空腹血糖值明顯下降,苦蕎低、中、高劑量組(kq-1,kq-2,kq-3)空腹血糖值顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。苦蕎提取物高劑量組(kq-3)與二甲雙胍組大鼠空腹血糖值水平接近(P>0.05),而苦蕎提取物低、中劑量組(kq-1、kq-2)與二甲雙胍組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見表1。2.2大血清胰島素測定結(jié)果給藥4周后,與模型組比較,kq-1,kq-2和kq-3組大鼠FINS值明顯下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖1。2.3胰島細(xì)胞數(shù)目和胰島數(shù)量變化圖2結(jié)果顯示,模型組與對照組相比,出現(xiàn)了以下改變:胰島體積縮小,細(xì)胞數(shù)目減少,部分大鼠出現(xiàn)胰島細(xì)胞變性、壞死的情況,胰島數(shù)量大幅減少。二甲雙胍組、kq-1、kq-2和kq-3組大鼠胰島與模型組相比,胰島體積增大,且胰島細(xì)胞均有增多,大部分大鼠胰島數(shù)量均有所增加。2.4大鼠胰島細(xì)胞凋亡圖3結(jié)果顯示:對照組胰島細(xì)胞核中幾乎無棕黃色,凋亡少見模型組胰島中大分部胰島細(xì)胞核中呈棕黃色,胰島細(xì)胞大量凋亡而二甲雙胍組、kq-l、kq-2和kq-3組大鼠胰島細(xì)胞核中與組相比,棕黃色表達(dá)顯著減少,表明胰島細(xì)胞凋亡減少?？嗍w提取物(250mg·k-1、500mg·kg-1、1g·kg-1)均能抑制胰島細(xì)胞凋亡,其效果同二甲雙胍組相似。光鏡下取5個視野,計算各組細(xì)胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組、kq-1,kq-2和kq-3組與模型組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。2.3大鼠胰臟組織caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果圖4結(jié)果顯示:與對照組相比較,模型組中胰臟組織包括胰島中caspase-3蛋白(棕黃色)大量表達(dá)。二甲雙胍組中caspase-3蛋白表達(dá)相對減弱,kq-1、kq-2和kq-3組結(jié)果顯示caspase-3蛋白表達(dá)均有降低,其中kq-3組caspase-3蛋白表達(dá)降低最明顯。kq-1、kq-2、kq-3、二甲雙胍組Caspase-3表達(dá)率,與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如表3。3苦蕎提取物對stz誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用建T2DM動物模型可以通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后,再注射低劑量的STZ損傷胰島功能,引起血糖升高,模擬T2DM的發(fā)病過程。注射STZ劑量的范圍在25～90mg·kg-1,然而隨著STZ劑量的增大,實(shí)驗(yàn)動物胰島β細(xì)胞破壞過多,實(shí)驗(yàn)動物模型則更傾向于1型糖尿病的表型特點(diǎn),影響研究結(jié)果,而且死亡率增加。本研究先采用高脂高糖誘導(dǎo)兩周后,隨后一次性給予低劑量的STZ(30mg·kg-1)造模,隨后對大鼠尾靜脈隨機(jī)測定其空腹血糖值,成功模擬出T2DM模型。研究表明,苦蕎提取物可有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖和血清胰島素水平,同時對胰島細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。正常情況下,Caspase-3以休眠狀態(tài)的酶原形式存在于正常細(xì)胞中,凋亡信號啟動后,Caspase-9激活并切割Caspase-3,使之轉(zhuǎn)為具有酶催化作用的活性形式?；罨蟮腃aspase-3可以切割蛋白質(zhì)底物,包括細(xì)胞骨架蛋白、參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的蛋白、參與DNA修復(fù)的酶如PARP、DNA-PKCS以及抗凋亡蛋白bcl-2等,最終引起細(xì)胞死亡。本