陰虛證糖尿病模型的建立

陰虛證糖尿病模型的建立

糖尿病是一組以慢性糖水平升高為特征的代謝疾病。主要特點是血糖過高、糖尿、多尿、多飲、多食、消瘦、疲乏,發(fā)病率極高。據(jù)權(quán)威部門介紹目前我國糖尿病患者總數(shù)已居全球第2位,而且全國糖尿病患病率成倍數(shù)增長,形勢十分嚴峻。中醫(yī)學(xué)認為糖尿病(消渴)的重要病機特點在于陰津虧損,燥熱偏盛,而以陰虛為本,燥熱為標。祖國醫(yī)學(xué)在千百年的發(fā)展中積累了治療糖尿病的獨到經(jīng)驗,因此,建立糖尿病中醫(yī)證候模型,可為中醫(yī)臨床上能夠有效地治療糖尿病提供更多更有力的依據(jù)。本實驗旨在建立一種更符合中醫(yī)臨床辨證、重復(fù)性和穩(wěn)定性好的陰虛證糖尿病動物模型。1材料表面1.1實驗動物及飼料大鼠,32只,雌性,體質(zhì)量180~210g,由上海斯克萊實驗動物公司提供。大鼠分籠飼養(yǎng),置于溫度(25±2)℃,濕度50%~60%的飼養(yǎng)室。每日光照8h。飲水為高溫滅菌水,飼料為常規(guī)飼料。動物均自由飲水、進食。1.2材料、注射液和儀器甲狀腺素(Thyroxin):長城藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號H31022151。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ):西格瑪奧里奇公司產(chǎn)品,批號87k1403。pH4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液:以無菌0.1mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液在冰浴中新鮮配制,然后調(diào)pH值至4.2,然后用直徑22μm微孔濾膜過濾滅菌。胰島素注射液:上海第一生化藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號H31020519,4℃冷藏保存。當(dāng)模型大鼠的空腹血糖超過16.8mmol/L時,連續(xù)2d皮下注射胰島素4u,超過21mmol/L時,皮下注射量為8u,連續(xù)2d。250g/L葡萄糖溶液:當(dāng)大鼠血糖<2.8mmol/L時,予大鼠灌胃適量的250g/L葡萄糖注射液。血糖儀:德國羅康全活力型血糖檢測儀,型號GN10215518,注冊號:2400925。電子體溫計:歐姆龍(大連)有限公司產(chǎn)品。型號MC-145,注冊號22000070。2模型建立及檢測2.1實驗動物分組大鼠隨機分為對照組(13只)、模型組(19只)。2.2模型復(fù)制動物購入后,先適應(yīng)性飼養(yǎng)5~7d,待動物適應(yīng)飼養(yǎng)室環(huán)境,體質(zhì)量開始增加時進行實驗。模型組大鼠先皮下注射甲狀腺素,連續(xù)7d,用量為每日0.2mg/kg。實驗第8天,禁食12h后,空腹腹腔一次性注射STZ。注射時,STZ先用pH4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液溶解,配成20g/L的溶液,注射劑量50mg/kg,30min內(nèi)注射完畢。對照組大鼠先皮下注射9.0g/L氯化鈉注射液,連續(xù)7d,然后一次性空腹腹腔注射pH4.2的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液,劑量均與模型組相同。2.3標本采集及檢測2.3.1觀察項目:動態(tài)觀察大鼠體質(zhì)量、食量、飲水量、尿量、神態(tài)、被毛、活動度、糞便,體溫等。2.3.2檢測項目:大鼠血糖、尿糖、尿蛋白、肝腎功能等。模型復(fù)制后48h,剪大鼠鼠尾取血,用羅氏血糖儀測空腹8h后的血糖,此后每周1次剪尾測空腹血糖。模型復(fù)制后48h,將大鼠放入代謝籠,收集其24h尿液,進行尿糖、尿蛋白檢測。每周1次。在模型復(fù)制后第3周,大鼠禁食8h后,用30g/L戊巴比妥鈉按30mg/kg空腹腹腔注射,大鼠麻醉后解剖胸腔,心臟取血,檢測肝功能和腎功能。2.4注意事項STZ要干燥避光-20℃保存,受潮后30min水解,故STZ要臨用前配制,大鼠腹腔注射時,動作要快。注射STZ后6~10h,由于大鼠胰島β細胞破壞,大量胰島素釋放,使血糖顯著降低,動物可產(chǎn)生驚厥、死亡,故應(yīng)在此期間監(jiān)測血糖,并給予250g/L葡萄糖灌胃進行預(yù)防,以降低病死率。2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件處理,結(jié)果以“xˉ±sxˉ±s”表示。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時,影響因素間比較采用兩因素析因設(shè)計的方差分析,組間均數(shù)比較采用t檢驗和方差分析;數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布時,采用符號秩和檢驗進行組間檢驗,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1大鼠糞便色,形態(tài)符合對照者一般資料對照組生長發(fā)育良好,體質(zhì)量處于平穩(wěn)增長狀態(tài);而模型組大鼠體質(zhì)量下降明顯,發(fā)育遲緩。對照組大鼠的食量、飲水量、尿量與實驗前相比無顯著變化,一直處于正常水平;模型組大鼠呈現(xiàn)明顯的“三多一少”癥狀,食量增加但體質(zhì)量下降明顯,飲水量和尿量是對照組的2倍以上,同時尿色加深。模型組大鼠糞便顏色較對照組為深,干硬粒小。對照組大鼠精神狀態(tài)良好,被毛潔白有光澤;模型組被毛粗糙發(fā)黃,黯淡無光澤,早期活動頻多,煩躁、多動、易怒,后期則變得精神萎靡,反應(yīng)遲鈍。用電子體溫計測量大鼠口腔溫度,模型組體溫比對照組平均高0.8℃。至實驗結(jié)束,模型組大鼠死亡4只,對照組全部成活。模型復(fù)制成功后,使用羅氏活力型血糖儀剪尾測大鼠空腹血糖。對照組大鼠血糖在正常范圍內(nèi),少波動。模型組大鼠空腹血糖均大于11.1mmol/L,隨著時間推移,波動不大,始終維持在11.1mmol/L。見表1。3.2兩組大鼠的尿糖和尿蛋白比較與對照組比較,模型組尿糖和尿蛋白均顯著增高(P<0.05)。見表2。3.3ast、alp、尿素氮、尿酸檢測與對照組比較,模型組谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、肌酐、尿素氮和尿酸顯著增高(P<0.05)。見表3。4t4模型的復(fù)制按國際糖尿病聯(lián)盟(internationaldiabetesfederation,IDF)通過的糖尿病分型方案將糖尿病分為1型(胰島素依賴型)和2型(非胰島素依賴型)。1型糖尿病發(fā)病時“三多一少”癥狀較明顯,與中醫(yī)學(xué)中論述的“消渴”相似。因此本研究所探討的糖尿病陰虛模型是以1型糖尿病為基礎(chǔ)的。關(guān)于用STZ誘發(fā)大鼠糖尿病模型,已經(jīng)有很多文獻報道過。STZ是一種藥效強大的烷化劑,能夠干擾葡萄糖的轉(zhuǎn)運,影響葡萄糖激酶的功能,誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂,是能夠?qū)е翫NA和線粒體破壞的細胞毒性物質(zhì)。大量文獻報道STZ對β細胞有特異殺傷作用,通過種種可能的機制,致胰島β細胞損傷。采用不同的給藥方法,可復(fù)制出速發(fā)型和遲發(fā)型兩種糖尿病動物模型。筆者介紹的方法屬于速發(fā)型,通過較大劑量的STZ一次性注射來減少胰島β細胞的合成與分泌。所形成的糖尿病模型傾向于1型糖尿病表現(xiàn),“三多一少”癥狀較明顯。大鼠對STZ毒性的敏感性較高,且大鼠體型較大,易于操作,耐受力較強,價格也比較低廉,故本研究選用大鼠作為模型動物。中醫(yī)學(xué)對陰虛證的描述為精血或津液虧損而導(dǎo)致的病理現(xiàn)象,多見于勞損久病或熱病之后而致陰液內(nèi)耗的患者。臨床表現(xiàn)多為五心煩熱、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、兩顴潮紅、口干舌燥、溲黃便干、盜汗遺精、舌紅少苔等陰虛內(nèi)熱的癥狀。陰虛證動物模型復(fù)制方法有多種。筆者采用甲狀腺素復(fù)制模型的優(yōu)點在于實施操作方便。甲狀腺素主要是由豬、牛、羊等食用動物的甲狀腺體制成,用于各種原因引起的甲狀腺功能減退。正常人服用會引起心動過速、頭痛、興奮不安、失眠、肌無力、震顫、出汗、潮熱、怕熱、體質(zhì)量減輕等類似陰虛的癥狀。實驗發(fā)現(xiàn),用T4復(fù)制模型后的動物表現(xiàn)及各種生化指標變化與“甲亢”的臨床表現(xiàn)相似,而且采用滋陰中藥治療后癥狀得到改善,反證