生長調(diào)節(jié)劑對杉木愈傷組織誘導(dǎo)及再生的影響

生長調(diào)節(jié)劑對杉木愈傷組織誘導(dǎo)及再生的影響

楠木是馬鞭草科的一種大型半落葉樹木，產(chǎn)于緬甸、印度、泰國和老撾。柚木具有生長迅速、紋理美觀、耐腐抗蟲和易于加工等優(yōu)良特性,被譽為最重要的熱帶珍貴用材樹種之一(White,1991;馬華明等,2003)。柚木用途極廣,適于制作高檔家具、木地板,也適于造船、橋梁以及露天建筑,是世界船艦、軍需海航及海港、雕刻、紅木家具和貼面板的重要用材(劉進(jìn)平等,2006)。隨著國際市場對柚木需求逐年上升,加上來自天然林的柚木越來越緊缺,自80年代以來,柚木傳統(tǒng)出口國如印度、泰國和印尼均已終止柚木的原木出口,目前僅有緬甸仍出口柚木原木,印尼只容許成品出口(馬華明等,2003),柚木在市場上十分短缺。我國無柚木天然林分布,現(xiàn)存柚木種質(zhì)資源基本由國外引進(jìn)。且柚木幼林期不耐霜凍,國內(nèi)適合種植的有海南、云南及廣東、廣西和福建的南部極少數(shù)地區(qū)(梁坤南等,2011)。選育耐寒抗性柚木優(yōu)良品種,在偶有霜凍地區(qū)推廣種植尤為重要,常規(guī)育種的周期長、難度大、選擇效率低(鄭勇奇,2001),轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用給柚木無性系耐寒品種創(chuàng)制提供了一條選育途徑。盡管20世紀(jì)80年代始,國內(nèi)開展了柚木組織培養(yǎng)研究(王寶生等,1980;曹月華等,1981),經(jīng)過多年研究,已形成了成熟的適合規(guī)?；a(chǎn)的組培快繁工藝技術(shù)(裘珍飛等,2001)。但目前尚未建立合適的再生體系,這很大程度上限制了通過基因工程改良柚木的進(jìn)程。本文擬通過柚木無性系愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生,建立柚木無性系再生體系,為柚木無性系轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供支撐。1材料和方法1.1材料表面實驗材料為中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所選育的印度優(yōu)良無性系71-14,以該無性系無菌組培瓶苗的、不帶腋芽的節(jié)間莖段為外植體。1.2材料的接種與培養(yǎng)根據(jù)單因素試驗確定4種植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、IBA、TDZ和NAA),各設(shè)4個濃度水平:6-BA(0.9、1.1、1.3、1.5mg·L-1)、IBA(0.04、0.08、0.12、0.16mg·L-1)、TDZ(0.02、0.05、0.08、0.11mg·L-1)和NAA(0.8、0.9、1.0、1.1mg·L-1)。用正交設(shè)計L16(45),16個處理(組合)(表1),每處理3次重復(fù),每重復(fù)6瓶。切取71-14無性系無菌瓶苗長0.5~0.7cm的節(jié)間莖段為外植體,每瓶接種5個外植體,每處理共接種外植體90個。以MS為基本培養(yǎng)基,添加蔗糖30g·L-1,瓊脂7.0g·L-1,pH調(diào)至5.8。高溫高壓滅菌。接種材料先在25℃恒溫箱中暗培養(yǎng)28d,再轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)室中進(jìn)行光培養(yǎng),光照時間為12h,光強2000lx,溫度為(25±2)℃;35d后觀察外植體愈傷組織的大小、顏色、質(zhì)地狀況,并統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率。1.3愈傷組織的生長愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;分化率(%)=已分化的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100%;褐化率(%)=褐化愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;植株再生系數(shù)=再生芽數(shù)/形成再生芽的愈傷組織數(shù)。所用數(shù)據(jù)采用GENSTAT和SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。應(yīng)用隸屬函數(shù)法計算,以每個處理多項指標(biāo)隸屬值的平均來評判處理對愈傷組織的誘導(dǎo)能力,平均值越大誘導(dǎo)能力越強。計算公式:M(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)式中,M(Xij)為第i處理j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,Xij為第i個處理j指標(biāo)的測定值,Xjmin和Xjmax分別為j指標(biāo)的最小和最大測定值。2結(jié)果與分析2.1不同濃度生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響對16個處理愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明(表2):愈傷組織平均誘導(dǎo)率為75.9%,處理間差異極顯著,其中處理3和處理12誘導(dǎo)率分別達(dá)到98.16%和84.23%,前者與另外的14個處理差異顯著。不同處理對愈傷組織大小影響差異也極顯著,其中處理4最大,平均直徑為1.78cm,處理7其次,為1.74cm,處理2平均直徑最低。從實驗設(shè)計看,處理4是6-BA濃度水平最低、其他3種生長調(diào)節(jié)劑濃度水平最高的一個組合,盡管處理4的愈傷組織平均直徑最大,但誘導(dǎo)率僅為80.51%,與誘導(dǎo)率最高的處理3差異顯著。處理3的誘導(dǎo)率最高,但愈傷組織平均直徑僅0.97cm,與平均直徑最大的處理4差異極顯著,在16個處理中排序倒數(shù)第二。處理3愈傷組織誘導(dǎo)率雖高,但平均直徑小,不利于下一步的愈傷組織繼代。褐化率低有利于愈傷組織繼代增殖,16個處理愈傷組織褐化率從0到10.71%,差異不顯著。不同生長調(diào)節(jié)劑濃度水平對愈傷組織的誘導(dǎo)率和平均直徑影響表現(xiàn)不同(表3)。6-BA和IBA的不同濃度水平間愈傷組織誘導(dǎo)率差異顯著,其中6-BA影響愈傷組織誘導(dǎo)率規(guī)律性明顯,隨著濃度增加,愈傷組織誘導(dǎo)率降低,即低濃度的6-BA更易于誘導(dǎo)愈傷組織;而IBA規(guī)律性不明顯;TDZ和NAA的不同濃度水平間愈傷組織誘導(dǎo)率差異不顯著。TDZ和NAA水平間平均直徑差異分別達(dá)極顯著和顯著;而6-BA和IBA水平間差異不顯著。4種生長調(diào)節(jié)劑濃度水平間的褐化率差異均不顯著。根據(jù)方差分析的顯著性和極差大小可知,6-BA和IBA是影響愈傷組織誘導(dǎo)率的主要因素。影響愈傷組織誘導(dǎo)率、平均直徑及褐化率大小的排序分別為6-BA>IBA>NAA>TDZ、TDZ>NAA>6-BA>IBA、NAA>TDZ>IBA>6-BA。2.2生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織的影響不同處理對71-14誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),愈傷組織以致密型居多,占45.8%,而疏松致密型和疏松型分別為23.6%和30.6%。16個處理間三種類型愈傷組織差異均達(dá)極顯著(表4)。其中處理1、2、3、5、6、9、11、15形成的愈傷組織以致密型為主,占52.1%~85.0%。處理10、14、16形成的愈傷組織以表面疏松,內(nèi)部致密為主,占50.8%~55.0%;處理4、8形成的愈傷組織以疏松型為主,分別占80.8%和56.7%,其他3個處理的三種類型愈傷組織所占比例相差不大。不同生長調(diào)節(jié)劑濃度水平對形成愈傷組織的質(zhì)地影響不一(表5,圖1),6-BA、IBA和TDZ不同水平間形成致密型愈傷組織差異極顯著,其中TDZ對致密型愈傷影響較大,水平間的極差為38.52%,其次為IBA(30.72%)、6-BA(27.09%),低濃度水平的6-BA和TDZ更易形成致密型的愈傷組織。6-BA對疏松致密型的愈傷組織影響最大,水平間差異極顯著,極差為38.67%,隨著濃度的增加,疏松致密型的愈傷組織所占比例增大;其他生長調(diào)節(jié)劑對疏松致密型愈傷組織的形成水平間差異不大。TDZ和IBA則對疏松型的愈傷組織影響較大,水平間差異達(dá)極顯著,其中TDZ水平間極差為35.81%,隨著濃度水平的增加,疏松型愈傷組織比例增大,IBA水平間的極差則為28.9%。根據(jù)方差分析的顯著性和極差大小,4種生長調(diào)節(jié)劑對致密型和疏松型愈傷組織影響大小的順序均為TDZ>IBA>6-BA>NAA;而對疏松致密型愈傷組織影響大小的順序為6-BA>IBA>NAA>TDZ。節(jié)間莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d左右即從切口處長出少量不規(guī)則淡黃色愈傷組織(圖2:A),60d左右愈傷可達(dá)0.5~1.5cm3(圖2:B)。致密型愈傷其結(jié)構(gòu)緊致,且呈黃綠色,部分愈傷組織表面有芽冒出(圖2:B),繼代生長慢;而疏松型愈傷組織呈淡黃色(圖2:C),其在繼代培養(yǎng)中生長速度極快,但只增大體積,外植體呈黃色,愈傷組織上無綠色芽點,多次繼代易褐化;前者和后者分別被稱為具再生能力和不具再生能力的愈傷組織。根據(jù)愈傷組織類型繼代生長情況,以愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織平均直徑和致密型所占比例采用隸屬函數(shù)法評定各處理的誘導(dǎo)能力,得出處理1(MS+0.9mg·L-16-BA+0.04mg·L-1IBA+0.02mg·L-1TDZ+0.8mg·L-1NAA)的平均隸屬值最大,為0.81,隨后依次是處理11、處理3和處理4,分別為0.67、0.65、0.57。處理1是綜合3項指標(biāo)最適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合,其愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織平均直徑和致密型所占比例分別為80.78%,1.648cm和83.0%。2.3再生苗和植株生長選擇黃綠色致密愈傷組織接入10個TDZ濃度的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行再生誘導(dǎo),約30d可見綠色芽點逐漸分化成再生植株,及時去掉無芽點的愈傷組織塊,并繼代2次后,芽點再生苗增多,莖干粗壯,顏色嫩綠,葉片開始舒展(圖2:D),部分再生苗苗高為3~5cm(圖2:E)。再分化培養(yǎng)50d時,部分再生植株高而且健壯。通過不同濃度TDZ對愈傷組織再生率的方差分析表明,TDZ對于不同愈傷組織的不定芽分化和植株再生系數(shù)均有顯著影響。當(dāng)TDZ濃度為0.066~0.132mg·L-1時,不定芽分化效果相對較好(表6),分化率為26.42%~36.54%,且分化出的不定芽大部分能正常生長,其中TDZ濃度為0.132mg·L-1時,愈傷狀態(tài)和再生苗長勢表現(xiàn)最好。3不同來源的外植體愈傷組織的誘導(dǎo)效果熱帶林木樹種植物組織培養(yǎng)常采用6-BA、NAA、IBA進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生,如桉樹(卜朝陽,2004)、相思(姬明,2006)、土沉香(汪騰躍等,2012)等,早期國外如Noerhadetal.(1980),Rosilahetal.(2005)、Kushalkaretal.(1996)柚木的組織培養(yǎng)研究也多采用6-BA、NAA、IBA。近20~30a一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑TDZ逐漸被應(yīng)用于組織培養(yǎng)中(裘珍飛等,2009)。對柚木愈傷組織的誘導(dǎo),單一生長調(diào)節(jié)劑可能不起作用,國內(nèi)郭彥彤等(2012)用0.5~2.0mg·L-1NAA誘導(dǎo)同一71-14無性系,結(jié)果無法獲得愈傷組織,而與6-BA共同作用,則誘導(dǎo)率達(dá)40.0%~86.7%,6-BA和NAA各水平差異極顯著,它們間的交互作用也達(dá)極顯著?；谶@一點,本研究采用6-BA、NAA、IBA、TDZ設(shè)計4因素4水平的正交實驗,結(jié)果顯示,各個處理(組合)對71-14愈傷組織的誘導(dǎo)率為52.27%~98.16%。對愈傷組織的誘導(dǎo)率影響最大的激素為6-BA,且低濃度6-BA的誘導(dǎo)率顯著高于高濃度的6-BA,與郭彥彤結(jié)果較吻合;Bagheletal.(2008)和Widiyantoetal.(2005)認(rèn)為最具有再生能力的愈傷組織是淺黃色或淺綠色的致密型愈傷組織,且從該類型的愈傷組織獲得柚木再生植株。本研究得出最適宜誘導(dǎo)71-14無性系愈傷組織的為處理1(MS+0.9mg·L-16-BA+0.04mg·L-1IBA+0.02mg·L-1TDZ+0.8mg·L-1NAA),可獲得較高的誘導(dǎo)率、較大及易于分化的愈傷組織。TDZ對71-14無性系愈傷大小和致密型質(zhì)地影響最大,難于再生的植物應(yīng)用TDZ可獲得體細(xì)胞胚及再生植株。如Widiyantoetal.(2005)用TDZ和IBA誘導(dǎo)柚木愈傷組織;Akrametal.(2008)用TDZ誘導(dǎo)叢生芽可使誘導(dǎo)率達(dá)100%。本研究采用10個濃度梯度的TDZ進(jìn)行愈傷組織植株再生研究發(fā)現(xiàn),TDZ能誘導(dǎo)愈傷組織的不定芽分化,分化率為15.39%~36.54%,再生系數(shù)為0.95~2.23,處理間的差異達(dá)顯著。盡管這兩個指標(biāo)不高,但能從愈傷組織獲得再生植株,并初步選出分化率和再生系數(shù)較佳的濃度,即MS+0.132mg·L-1TDZ,其愈傷生長狀態(tài)和再生植株苗的長勢最好。在愈傷誘導(dǎo)過程中,基因型不同是影響實驗結(jié)果的一個重要因素。即使是來自同一種源不同個體,因基因型不同,對同一生長調(diào)節(jié)劑的敏感性不同。郭彥彤等(2012)發(fā)現(xiàn)柚木同一種源的兩個無性系71-5和71-14誘導(dǎo)愈傷組織要求的濃度范圍不一致。至于不同來源的外植體所建立的再生體系之間可能更難完全具備可重復(fù)性。本研究曾參考Akrametal.(2009)和郭彥彤等(2012)獲得的培養(yǎng)基配方進(jìn)行試驗,但效果不理想,形成的愈傷組織量少,水澤化,并在持續(xù)培養(yǎng)中愈傷極易褐化死亡。柚木愈傷組織誘導(dǎo)及分化是再生體系建立和基因工程的前提。本研究通過激素和培養(yǎng)基的優(yōu)化,建立柚木無性系71-14愈傷組織再生體系,初步解決了胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低,幾乎無進(jìn)一步分化等難題,為后期建立高效再生體系提供技術(shù)支持,也為建立柚木遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。但植株再生分化率仍較低,最高僅36.54%,達(dá)不到直接進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的條件。這是由于木本植物再生率低、難度大,無性系植株再生難度更大,其外植體與其他胚性外植體(Akrametal.,2008,20