環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法嚴(yán)海生

2012.09.21

聚合酶鏈武反應(yīng)技術(shù)(PCR)自1985年問(wèn)世來(lái)，以其靈敏性、特異性和快速性在醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，由此可見(jiàn)核酸擴(kuò)增技術(shù)的重要性。PCR方法依據(jù)其靈敏度高、特異性好，成為目前最精準(zhǔn)的基因診斷方法。然而常規(guī)PCR技術(shù)存在如下缺陷：(1)需要昂貴的PCR儀；(2)多因素影響擴(kuò)增效果；(3)常引起非特異性擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，一般需要幾個(gè)小時(shí)，難以在基層推廣應(yīng)用等諸多的缺陷，急需更新的方法來(lái)替代。背景介紹近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。根據(jù)是否需要溫度循環(huán)也可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是非等溫?cái)U(kuò)增體系，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)等。另一類(lèi)是等溫?cái)U(kuò)增體系，如賴(lài)解旋酶恒溫基因擴(kuò)增(HDA)、核酸依賴(lài)的擴(kuò)增(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等系統(tǒng)，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)滿(mǎn)足了上述要求。1、賴(lài)解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)（HDA）HDA技術(shù)是依靠解旋酶解開(kāi)雙鏈DNA，結(jié)合蛋白(SSB)保持單鏈DNA狀態(tài)，DNA聚合酶催化靶片段的擴(kuò)增。反應(yīng)溫度依據(jù)使用的酶的不同而不同。2、核酸依賴(lài)的擴(kuò)增（NASBA)

1990年首次提出的由一對(duì)引物引導(dǎo)的連續(xù)均一的體外特異核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增酶促過(guò)程。反應(yīng)在42℃進(jìn)行，擴(kuò)增速度與PCR一樣快，在3小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。

NASBA反應(yīng)是由AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶3種酶共同協(xié)作完成的。引物

I的3’端與靶序列互補(bǔ)，5’端具有被靶RNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子序列，引物II的5’端序列與靶

RNA序列相同。NASBA整個(gè)反應(yīng)分為兩相：非循環(huán)相和循環(huán)相。如開(kāi)始用RNA靶序列，反應(yīng)將如此進(jìn)行：首先，5’端含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的引物I與靶序列復(fù)性，并由反轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生一cDNA鏈，以RNaseH降解新生成的雙鏈螺旋中的RNA，這樣生成了帶有啟動(dòng)子序列的cDNA，以上稱(chēng)為非循環(huán)相。然后，引物II與裸露的cDNA復(fù)性，進(jìn)行第二鏈的合成，啟動(dòng)子序列變?yōu)殡p鏈。3、滾環(huán)DNA擴(kuò)增線性RCA是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA聚合酶的作用下被延伸，產(chǎn)物是與原始引物相連的DNA單鏈。線性RCA只適用于環(huán)狀核酸的擴(kuò)增。例如環(huán)狀病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體。在現(xiàn)有的核酸擴(kuò)增技術(shù)中，根據(jù)其特點(diǎn)可以分為兩類(lèi)：一類(lèi)是把靶核酸的直接擴(kuò)增，一類(lèi)是信號(hào)放大擴(kuò)增。其中，滾環(huán)擴(kuò)增是一種既能直接擴(kuò)增靶核酸，又能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的擴(kuò)增方法。RCA分線性和指數(shù)擴(kuò)增兩種形式。（1）線性RCA（2）指數(shù)RCA

指數(shù)RCA與線性RCA相似，它采用了第二種引物。該引物序列與環(huán)狀DNA序列完全一致。在RCA循環(huán)中，此引物與第一次線性RCA產(chǎn)物結(jié)合并在聚合酶的作用下延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針的模板，這樣一來(lái)產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。指數(shù)RCA也可用于非環(huán)狀DNA的擴(kuò)增。（3）基于鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增這種探針包括以下3個(gè)部分：5’端T1和3’端T2為檢測(cè)臂，與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，可在連接酶的作用下使探針環(huán)化；P1和P2為滾環(huán)擴(kuò)增的通用引物區(qū)，實(shí)現(xiàn)環(huán)狀鎖式探針的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增。

如果體系中存在檢測(cè)的靶序列，鎖式探針的兩個(gè)檢測(cè)臂被連接起來(lái)，形成環(huán)化的鎖式探針，形成的鎖式探針和靶序列的雜交會(huì)產(chǎn)生較為穩(wěn)定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，因而也保證了環(huán)化探針的穩(wěn)定性。環(huán)化的鎖式探針可以通過(guò)通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大以及多元檢測(cè)。如果體系中不存在需要檢測(cè)的靶序列，線形鎖式探針就不會(huì)被連接酶連接形成環(huán)化的鎖式探針，也就不會(huì)被通用引物擴(kuò)增。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermalamplification，簡(jiǎn)稱(chēng)LAMP)是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)在1h內(nèi)能擴(kuò)增出109靶序列拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。

LAMP等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包含了內(nèi)外引物、模板DNA、BstDNA聚合酶、dNTP和緩沖液。其基本操作過(guò)程是將LAMP反應(yīng)體系(除BstDNA聚合酶)在95℃加熱5min后，冷卻，再加入8UBstDNA聚合酶，在63％保溫60min，然后在高于8O℃的溫度下加溫2min終止反應(yīng)。

1、LAMP反應(yīng)過(guò)程包括啞鈴狀模板合成階段、循環(huán)擴(kuò)增階段、伸長(zhǎng)和再循環(huán)階段LAMP原理小動(dòng)畫(huà)(1),Electrophoresis,

(2)，byproduct.2、Detection2、Detection(4),Real-timePCR(3),SYBRGreenⅠ3、Development1、RT-LAMPBycombinationwithreversetranscription,LAMPcanamplifyRNAsequenceswithhighefficeency.2、IsolationofSingle-StrandedDNA1）LAMPreaction2）PrimerextensionLAMP

TheproductsthatwereamplifiedbyLAMPweredigestedwithTspRIandthenextendedusingaprimerthathybridizestothe39overhangingsequenceatacleavagesite.3、Loop-primeLoopprimershybridizetothestem-loops,exceptfortheloopsthatarehybridizedbytheinnerprimers,andprimestranddisplacementDNAsynthesis.RESULT:signalincreasewasdetectedat14minand44minwithandwithouttheloopprimers,respectively4、OptimizedconditionsforLAMP1、Tmvalue:

F1c、B1c>F2、B2，inorderthataloopedoutstructreformedimmediatelyafterreleaseofthesingle-strandedDNAfromthetemplateF2、B2>F3、B3，toensurethatsynthesisoccurredearlierfromtheinnerprimesthanfromtheouterprimes2、astem–loopDNAiscriticalforcycling,thepreferablesizebetweenF2candF1cis40base3、thesizeofthetargetDNAshouldbesettolessthan300bp4、DNApolymeraseisanothorcriticalfactor,5、ChemicalsdetabilizingtheDNAhelixcanelevateamplificationefficiencies,thepresenceof0.5-1.5MbetaineorL-prolinestimulatednotonlytheoverallrateofthereaction,butalsoincreasedtargetselectivitywithasignificantreductioninamplificationofirrelevantseqences

5、Advantages1、highefficiencywithoutinfluenceofnon-targetDNA,onlyneedafewcopies2、highspecific

3、highsensitivity

4、simpleandeasytoperform5、easydetection6、RT-LAMP1、theriskofcontaminationresultingfromthehighquantityofamplifiedDNAproduced2、LAMPmethodsarenotfeas