宏基因組學(xué)的一般研究策略

宏基因組學(xué)的一般研究策略摘要:宏基因組學(xué)是目前微生物基因工程的一個(gè)重要方向與熱點(diǎn)。它把微生物的總?cè)后w特性與基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)手段結(jié)合了起來(lái)，包括從環(huán)境樣品中提取總DNA、再用可培養(yǎng)的宿主微生物建立文庫(kù)及篩選目的克隆和基因。該法是研究不可培養(yǎng)微生物、尋找新的基因和開(kāi)發(fā)新活性產(chǎn)物的重要新途徑。它避開(kāi)了微生物分離、純化和培養(yǎng)的步驟,大大擴(kuò)展了微生物資源的利用范圍。本文旨在介紹宏基因組學(xué)的一般研究方法并結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)情況,對(duì)這一嶄新領(lǐng)域中的最新研究策略進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。關(guān)鍵詞:宏基因組學(xué),不可培養(yǎng)微生物,文庫(kù)構(gòu)建,文庫(kù)篩選，研究策略StrategiesforaccessingmetagenomicsfordesiredapplicationsAbstract:Metagenomicsisanewfieldofmicrobialgeneticengineering.Ithasthecharacteristicsofmicrobialecologyandthemethodologyofgenomics.MetagenomicsincludesgenomicDNAisolation,libraryconstructionandscreeningstrategies,andcanbeusedinthediscoveryofnewgeneandbiocatalystsandinthestudyofunculturedmicroorganism.Metagenomicscanovercometheadvantagesofisolationandcultivationproceduresintraditionalmicrobialmethod,andthusgreatlybroadenthespaceofmicrobialresourceutilization.Inthispaper,wemainlyreviewedthemetagenomicmethodology,togetherwiththelatestadvancesandnovelstrategyinthisresearchfield.Keywords：Metagenomics;Unculturedmicroorganism；Libraryconstruction；LibraryscreeningResearchstrategies大自然中蘊(yùn)藏著無(wú)數(shù)具有重要價(jià)值的微生物及其活性產(chǎn)物,也是新基因及生物學(xué)資源的重要源泉，對(duì)其進(jìn)行研究成為微生物學(xué)和分子生物學(xué)研究的一個(gè)重要方向。然而人們現(xiàn)在能夠培養(yǎng)與利用的不到環(huán)境中總微生物的1%[1]。宏基因組學(xué)(metagenomics)是直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的總DNA,避開(kāi)了分離、純化和培養(yǎng)微生物的過(guò)程來(lái)構(gòu)建宏基因組文庫(kù),用基因組學(xué)的研究策略來(lái)研究環(huán)境樣品中的總微生物的組成及其在群落中的功能等?，F(xiàn)在,宏基因組學(xué)技術(shù)方法已在微生物多樣性,微生物細(xì)胞間的相互作用,新基因和新型生物催化劑的開(kāi)發(fā)，新的抗生素的開(kāi)發(fā)及環(huán)境生態(tài)等方面得到了廣泛應(yīng)用[2]。本文旨在介紹宏基因組學(xué)的一般實(shí)驗(yàn)方法并結(jié)合我們的研究情況,對(duì)這一嶄新領(lǐng)域中的最新研究策略進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。深化了我們對(duì)這一學(xué)科的認(rèn)識(shí),促進(jìn)了該學(xué)科的進(jìn)步。1宏基因組學(xué)研究策略1.1宏基因組學(xué)概要宏基因組學(xué)是Handelsman等于1998年提出的[3],可見(jiàn)是一門很新的學(xué)科，其隨著基因組實(shí)驗(yàn)手段，生物信息學(xué)和測(cè)序技術(shù)等的日新月異也迅猛發(fā)展了起來(lái)，這個(gè)新學(xué)科是以環(huán)境樣品的總微生物基因組為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)測(cè)序分析、文庫(kù)評(píng)價(jià)、產(chǎn)活性物質(zhì)及其基因的克隆的獲取和基因功能的鑒別，對(duì)微生物種群組成與生物量、生態(tài)學(xué)關(guān)系、生物化學(xué)關(guān)系與環(huán)境關(guān)系以及功能活性進(jìn)行研究[4]。其主要過(guò)程包括樣品和基因的富集和提取;宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建;目的基因的篩選;目的基因活性產(chǎn)物的表達(dá)(圖1)。1.2微生物及其基因的富集在文庫(kù)篩選過(guò)程中由于目的基因比例較小,對(duì)環(huán)境中微生物的富集不但可提高基因總量，有利于基因的提取，還可增加目的基因的比例，如Kouker等用橄欖油富集產(chǎn)脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5]，橄欖油不僅可作為底物，還可誘導(dǎo)脂肪酶的合成。目前富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平和基因水平。其中細(xì)胞水平主要是用選擇培養(yǎng)基來(lái)富集某些微生物,常圖1環(huán)境微生物宏基因組學(xué)研究策略[6]Fig.1Generalprocessofmetagenomicstrategie[6]用的就是上面例子中的底物選擇法[5]。每一個(gè)事物都有其兩面性，富集培養(yǎng)雖然擴(kuò)大了基因的總量，卻很容易使部分微生物及其攜帶的基因丟失?；蛩礁患械姆€(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP)很有代表性,它是用穩(wěn)定同位素標(biāo)記底物,用相對(duì)量較大的原子摻入到具有活性的核酸里,采用密度梯度離心法將其分開(kāi),標(biāo)記的核酸可作為PCR的模板,用來(lái)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)[7]。目前，SIP與宏基因組學(xué)結(jié)合的報(bào)道還不多，但其潛力與優(yōu)勢(shì)很明顯，利用SIP可提高新基因發(fā)現(xiàn)的幾率。1.3環(huán)境中總DNA的提取宏基因組學(xué)要分析的樣品成分復(fù)雜,要獲得高濃度、大片段、無(wú)偏好的總DNA是宏基因組學(xué)技術(shù)的難點(diǎn)，也是其重點(diǎn)。現(xiàn)在提取DNA的方法大體有兩種:其一是直接提取法,又稱原位提取法，它用化學(xué)和物理方法直接裂解樣品中的微生物使DNA得以釋放,再抽提總DNA,并對(duì)DNA進(jìn)行純化。其中以Zhou法[8]和Tsai[9]法最為常用。該法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、成本低,能代表某一生境的微生物群落多樣性。其缺點(diǎn)是會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞裂解不完全或DNA與樣品雜質(zhì)共沉淀而難以分離,故一般要再進(jìn)行DNA純化這一步,它所提取的DNA片段較小(1kb~50kb),適合小片段文庫(kù)的構(gòu)建;其二是間接提取法,即異位提取法,是采用差速離心等方法將細(xì)胞從樣品中分離出,再提取DNA,該法獲得的DNA純度高、DNA片段大(20kb~500kb),適合構(gòu)建大片段的基因文庫(kù)。但操作繁瑣、成本高、DNA產(chǎn)率低且有偏嗜性,其PCR等方法獲得各種細(xì)菌rDNA,測(cè)序后進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析,即可描述環(huán)境微生物的遺傳多樣性,使人們對(duì)大量不可培養(yǎng)的微生物群體有了全新的認(rèn)識(shí)[37]。例如Tyson[33]等研究了生長(zhǎng)在流動(dòng)的酸礦外排液表面的嗜酸生物膜的群落結(jié)構(gòu)及其代謝途徑,從中鑒定出了5個(gè)基因,并由微生物之間的基因的功能互補(bǔ)揭示了它們的碳氮固定和產(chǎn)生能量的代謝過(guò)程和這些微生物在極端環(huán)境中的生存策略[17]。宏基因組擴(kuò)大了生態(tài)學(xué)研究的對(duì)象,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,以功能基因?yàn)榛A(chǔ)的功能生態(tài)學(xué)將成為未來(lái)的熱點(diǎn)，這才是真正意義上的微生態(tài)[32]。2.4生物降解作用研究微生物是適應(yīng)環(huán)境能力最強(qiáng)的物種,環(huán)境污染往往伴隨微生態(tài)的變化[34,35]。宏基因組技術(shù)可以研究不可培養(yǎng)微生物，發(fā)掘它們的基因資源，獲得具有某些物質(zhì)降解能力的活性物質(zhì)，進(jìn)而了解特定環(huán)境下微生物或活性物質(zhì)的耐受機(jī)理，用于污染的修復(fù)。如，我們可建立污染地域的宏基因組文庫(kù)，篩選具有某污染物降解能力的克隆再用遺傳工程手段，把從宏基因組中分離出的基因組編成具有其他活性成分、或可降解污染物功能的基因簇用于污染物的處理。Kube[36]等建立了黑海海床的Fosmid文庫(kù)，篩選到了厭氧環(huán)境下苯甲酸鹽類降解相關(guān)酶的基因，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析后，完成了苯甲酸鹽的厭氧代謝通路，并找到了控制此過(guò)程的關(guān)鍵基因?？梢?jiàn)本技術(shù)對(duì)解決三廢問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展有一定的意義。3結(jié)語(yǔ)與展望宏基因組學(xué)作為一門新興學(xué)科，展示出強(qiáng)大的生命力與潛力，越來(lái)越多的科研人員將眼光投向它，其重心也從多樣性分析轉(zhuǎn)移到活性物質(zhì)的篩選上來(lái)[37]。雖然該技術(shù)在應(yīng)有上碩果累累。但由于它剛剛起步,還有些技術(shù)方法不夠成熟。主要有三方面[38-43]，一是DNA的提取方法需進(jìn)一步完善，外源基因表達(dá)量少和缺乏高效的篩選方法。二是對(duì)更適宜的載體的探索真核表達(dá)宿主細(xì)胞的開(kāi)發(fā)，研究和探索多種真菌宿主勢(shì)在必行。三是需要把宏基因組學(xué)與生物信息學(xué)和生物芯片技術(shù)等結(jié)合起來(lái)，生物信息學(xué)為宏基因組復(fù)雜的序列信息的分析提供了方便。如芯片技術(shù)已用于檢測(cè)微生物群落的基因表達(dá)。隨著文庫(kù)構(gòu)建和篩選策略的不斷提高,異源基因表達(dá)能力和產(chǎn)量的增加,宏基因組學(xué)技術(shù)將成為研究環(huán)境微生物多樣性,篩選新的功能基因和生物活性物質(zhì)的重要手段，它的前景是很誘人的，相信經(jīng)過(guò)我們不斷的摸索與創(chuàng)新，并結(jié)合現(xiàn)在先進(jìn)的儀器與技術(shù)，它將會(huì)發(fā)展成為生物學(xué)中璀璨的一顆明珠，更好的發(fā)揮出它應(yīng)有的潛力。參考文獻(xià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