還原型抗壞血酸（ascorbicacidAsA）含量測定試劑盒說明書

第第頁還原型抗壞血酸（ascorbicacid，AsA）含量測定試劑盒說明書還原型抗壞血酸（ascorbicacid，AsA）含量測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。測定意義:AsA又稱維生素C。AsA是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底物等。作為植物細(xì)胞中最重要的抗氧化劑，AsA在保護(hù)葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用，也是衡量農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一、測定原理：在乙酸溶液中，抗壞血酸與固藍(lán)鹽B反應(yīng)生成黃色的草酰肼–2–羥基丁酰內(nèi)酯衍生物，在最大吸收波長420處測定吸光度。自備儀器和用品：研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。試劑組成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。試劑一：液體4mL×1瓶，4℃保存。試劑二：液體6mL×1瓶，4℃保存。試劑三：粉劑×2瓶（棕色），4℃避光保存。臨用前配制，每瓶加入7mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑4℃下可保存3天。樣品中AsA提取：1.組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。2.細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。3.血清等液體：直接測定。AsA測定操作：1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到420nm，蒸餾水調(diào)零。2.在EP管中加入下列試劑試劑名稱（L）測定管空白管樣本100提取液100試劑一3030試劑二5050試劑三120120水700700混勻，25℃靜置20min，吸取200L加入微量石英比色皿/96孔板中，420nm下測定各管吸光值。ΔA=A測定A空白。注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。AsA含量計(jì)算公式:a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0088x0.018，R2=0.9978(1).按蛋白濃度計(jì)算AsA(μg/mgprot)=(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷（Cpr×V樣）=113.63×(ΔA+0.018)÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算AsA(μg/g鮮重)=(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷(W×V樣÷V樣總)=113.63×(ΔA+0.018)÷W(3).按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算AsA(μg/104cell)=(ΔA+0.018)÷0.0088×V樣÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)=113.63×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算AsA(μg/mL)=(ΔA+0.018)÷0.0088=113.63×(ΔA+0.018)V樣：加入樣品體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1.0mL;Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量（g）。b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0044x0.018，R2=0.9978(1).按蛋白濃度計(jì)算AsA(μg/mgprot)=(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷（Cpr×V樣）=227.27×(ΔA+0.018)÷Cpr(2).按樣本質(zhì)量計(jì)算AsA(μg/g鮮重)=(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷(W×V樣÷V樣總)=227.27×(ΔA+0.018)÷W(3).按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算AsA(μg/104cell)=(ΔA+0.018)÷0.0044×V樣÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)=227.27×(ΔA+0.018)÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算AsA(μg/mL)=(ΔA+0.018)÷0.0044=227.27×(ΔA+0.018)V樣：加入樣