備課素材：PCR技術 高中生物學選擇性必修三

PCR技術PCR

(polymerasechainreaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術，在1985年由美國Cetus公司的KaryMullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。KaryMullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。一、PCR的原理在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。聚合酶鏈式反應用于擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復制很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為堿基對（basepair,bp）。二、PCR反應成分template過多：非特異性條帶增加。過少：PCR產(chǎn)量降低。primer預擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。偏高：非特異產(chǎn)物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。polymerase耐高熱偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴增。偏低：產(chǎn)物量降低。dNTPdATP、dGTP、dCTP、dTTP過高：加快反應速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應速度下降，可提高實驗的精確性。bufferMg2+Taq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應的特異性和擴增片段的產(chǎn)量。過量：能增加非特異擴增并影響產(chǎn)率。過低：則酶活性顯著下降。10~50mMTris-Cl(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性25~50mMKCl促進引物退火，＞50mM會抑制Taq酶的活性。100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)對酶有一定的保護性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙酰化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。上述也就是現(xiàn)在廣泛使用的mix的主要成分。三、PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：變性(Denaturation)：利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物完全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。退火或稱接合,復性(Annealling)：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。延伸(Extension)：DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermusbrockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。四、PCR反應條件優(yōu)化1、變性溫度和時間：保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C,30~60s，再復雜的DNA分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。2、復性溫度和時間:PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。需根據(jù)引物的Tm值具體設定。3、延伸溫度和時間:一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb,1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。4、循環(huán)數(shù):其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。五、PCR延伸技術由PCR延伸而來的技術很多，這里只介紹日常實驗中常用到的幾種。1.touchdownPCR降落PCR，主要用于PCR的條件的優(yōu)化。在許多情況下引物的設計使得PCR難以進行，例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低，但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。因此，前面幾個循環(huán)的起始退火溫度設定為比引物的最高熔解溫度（Tm）再高幾度。前幾循環(huán)溫度逐漸下降至設定的最終Tm。通過較高溫度獲得特異性匹配較高的模板后，再以較低溫度高效率擴增。2.RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。3.real-timePCR/quantitativePCR實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。4.nestedPCR先用低特異性引物擴增幾個循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴增。5.SOEPCR重疊延伸PCR分為2種：用重疊延伸PCR做定點突變和

用重疊延伸PCR做序列缺失突變，即重疊延伸PCR技術(genesplicingbyoverlapextensionPCR,簡稱SOEPCR)5.1用重疊延伸PCR做定點突變（由于原理簡單，直接上圖）該步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產(chǎn)物末端加A，會造成產(chǎn)物移碼突變。5.2用重疊延伸PCR做序列缺失突變6.高GC含量PCR具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。富含GC的序列同時也涉及二級結構。因此，富含GC的序列可導致DNA聚合酶沿模板擴增時“卡頓”并干擾DNA合成。為了擴增高GC含量的片段，雙鏈模板必須解離，以便引物與模板結合，并使DNA聚合酶能夠讀取到序列。為了克服強GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加劑或輔助溶劑來幫助DNA變性。然而，這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需進行相應的調(diào)整。高合成能力的DNA聚合酶由于與模板的結合能力更強，有利于完成高GC含量PCR。超高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因為較高的變性溫度（如，使用98°C代替95°C）可能會促進雙鏈解離和PCR擴增。7.AS-PCR等位基因特異性PCR（allelespecificPCR，AS-PCR），是指利用引物與模板之間的堿基錯配可以有效地抑制PCR反應，進而達到模板區(qū)分（等位基因區(qū)分）的目的。由于PCR過程中引物延伸是3'端開始的，所以3'末端的堿基對引物的延伸來說處于至關重要的位置。如果這個堿基與模板互補，則引物能不間斷延伸，PCR可以正常進行，