分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

分子生物學(xué)根底試驗(yàn)分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不行缺少的一局部。為提高學(xué)生在分子生物學(xué)技術(shù)方面的動(dòng)手力量，生物技術(shù)綜合試驗(yàn)室主要開(kāi)設(shè)常用而根本的分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)。它的內(nèi)容包括質(zhì)粒DNA的制備；DNA的重組；PCR基因擴(kuò)增等等。試驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的小量制備一、試驗(yàn)原理要把一個(gè)有用的外源基因通過(guò)基因工程手段源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體。載體的設(shè)計(jì)和應(yīng)用是A:(1)是一個(gè)復(fù)制子，載體有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制生殖〕載體A鏈上有1〕載體具有選擇性的遺傳標(biāo)記，如有抗四環(huán)素基因，抗霉素基因〕等，以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，也可依據(jù)這個(gè)標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分別篩選出來(lái)。細(xì)菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)?！瞤lasmid〕1～120kb之間，具有雙鏈閉合環(huán)狀構(gòu)造的DNA分子，主要覺(jué)察于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄力量，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。它可獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中，它離開(kāi)宿主的細(xì)胞就不能存活，而它掌握的很多生物學(xué)功能也是對(duì)宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制〔stringentcontrol〕〔relaxed120個(gè)以上。通常大的質(zhì)粒如FColEⅠ質(zhì)?！埠挟a(chǎn)生大腸桿菌素1基因DNA復(fù)制受阻，而松弛型ColEⅠ質(zhì)粒連續(xù)復(fù)制12－16h，由原來(lái)20多個(gè)拷貝可擴(kuò)增至1000－3000個(gè)拷貝，此時(shí)質(zhì)粒DNADNA的含量由原來(lái)的240％－50％。本試驗(yàn)分別提純化的質(zhì)粒pBR322、pUC19ColEⅠ衍生的質(zhì)粒。全局部別質(zhì)粒DNA:培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分別和純化質(zhì)粒DNA。承受溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉〔SDS〕可使細(xì)胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑〔SDS〕處理后，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來(lái)，而質(zhì)DNADNA。DNA的相對(duì)分子量一般在106－107范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR322的相對(duì)分子質(zhì)量為2.8×106，pUC191.7×106。在細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)DNA〔covalentlyclosedcircularDNA，簡(jiǎn)稱cccDNA〕常以超螺旋形式存在。假設(shè)兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋nr，簡(jiǎn)稱。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以cccDNA形式存在，它比其開(kāi)環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本試驗(yàn)中，自制DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。二、試驗(yàn)?zāi)康陌盐兆畛Ｓ玫奶崛≠|(zhì)粒DNA的方法和檢測(cè)方法。了解制備原理及各種試劑的作用。三、試驗(yàn)材料和試劑材料：大腸桿菌E.col，含2質(zhì)粒。試劑：LB培育基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaClNaOHpH7.3左右。如固體培育基則添加15g/L瓊脂。溶液ⅠT緩沖液0LlL。滅菌后存放。溶液Ⅱ〔內(nèi)含1％)：預(yù)先配制1％S母液，臨用前一天晚上參加0.2mol/LNaOH，4℃保存。溶液Ⅲ8乙酸鉀溶液L乙酸鉀、冰乙酸、雙蒸餾水。酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚為重蒸酚，配制時(shí)，先將氯仿中參加異戊醇，使其體積比24:1，然后等量的參加重蒸酚，混勻，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，于棕色1℃保存。無(wú)水乙醇7.70％乙醇8.pH8.0TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTA，其中含RNA20μg/mL。儀器：恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩器、EP管(1.5mL微量離心管)、加樣器(20uL～lmL)、吸頭。四、操作步驟〔一〕培育細(xì)菌將帶有質(zhì)粒2的大腸桿菌接種在含L的B液體培育基中℃振蕩培育過(guò)夜。留意：添加Amp時(shí)，須待LB培育基冷卻到50℃左右方可參加?！捕硰木渲锌焖偬崛≈苽滟|(zhì)粒DNA1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，15000rpm3min。棄上清，參加150μL GET緩沖液，在渦旋混合器上充分混勻，在室溫下放10min。200μL0.2mol/LNaOH(1％SDS)，加蓋，顛倒〔不要振蕩〕2～3次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過(guò)5min。參加150μL15min。5．4℃，10000rpm5min，上清液吸至另一干凈的1.5mLEp中，如上清液渾濁則需重離心一次。/氯仿液，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心2min，留神吸取上清液，轉(zhuǎn)移1.5mLEp管中，留意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。向上清液參加2倍體積無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置３min。用離心機(jī)于10000rpm5min。小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使全部液體流出。用0.5mL70％乙醇洗滌沉淀一次，10000rpm3min(將離心管倒置于一張紙巾上)，備用。25uLDNARNase(20ug／mL)TE重溶解DNA，置于4℃保存，供下午電泳使用。貯存于-20℃?zhèn)溆?，可長(zhǎng)期保存。五、留意事項(xiàng)收集菌體提質(zhì)粒前，培育基要去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。在添加溶液Ⅱ與溶液Ⅲ后溶液的混合肯定要嚴(yán)峻，承受上下顛倒的方法，千萬(wàn)不能在旋轉(zhuǎn)器上猛烈振蕩。其中參加溶液Ⅱ后，溶液變成澄清，并有黏性；參加溶液Ⅲ后，消滅絮狀沉淀。苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴(yán)峻燒傷及衣物損壞，使用時(shí)應(yīng)留意。如不留神皮膚上遇到苯酚則應(yīng)用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。苯酚可以用于抽提純化DNA，由于苯酚的氧化產(chǎn)物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所使用的苯酚在使用前0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)層溶液，由于上層是Tris-HCl液隔絕空氣層。

/氯仿/異戊醇時(shí)應(yīng)取下酚/氯仿//氯仿/色層吸入，其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。試驗(yàn)中，涉及酚/Ep管，全部棄用，不回收。有些質(zhì)粒本身可能在某些菌種中穩(wěn)定存在，但經(jīng)過(guò)屢次移接有可能造成質(zhì)粒喪失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)挑單菌落。六、思考題裂解細(xì)菌時(shí)需留意的事項(xiàng)有哪些？重懸應(yīng)完全：用槍吹打后應(yīng)在渦旋振蕩器上重懸充分，使得細(xì)胞能與液體充分接觸發(fā)生作用；菌量應(yīng)適當(dāng)：應(yīng)防止細(xì)菌過(guò)多所造成的裂解不完全；DNA產(chǎn)量下降。質(zhì)粒的根本性質(zhì)有哪些？質(zhì)粒的復(fù)制通常一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用掌握要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)整個(gè)遺傳單位定義為復(fù)制子。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式是不同的，有的可打算復(fù)制的方式，如滾環(huán)復(fù)制和θ復(fù)制。在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)；質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)有限，大約1～幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。質(zhì)粒的不相容性〔4〕轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到宿主內(nèi)。兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性及DNA限制系統(tǒng)時(shí)消滅的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存〔4〕轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒具轉(zhuǎn)移性。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到宿主內(nèi)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中各溶液的作用是什么？pH8.0G.E.T.緩沖液：葡萄糖 ：使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快地沉積到管子底部，增加溶液的粘度，削減抽提過(guò)程中的機(jī)械剪切作用，防止破壞質(zhì)粒DNA；EDTA-Na2

：可除去細(xì)胞壁上的Ca+Mg等二價(jià)離子，DNA酶對(duì)質(zhì)粒分子的降解作用；Tris-HCl ：使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍。H2O ：溶劑；NaOH：破壞氫鍵，使DNA分子變性；SDSDNA和染色體DNA；乙酸鉀：能沉淀SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物以及附著其上的染色體DNA；也能使多余的SDS-Na+轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀偷腟DS-K+而沉淀；并能中和溶液的堿性，使質(zhì)粒DNA復(fù)性；酚/氯仿液：重蒸酚 ：一種猛烈的蛋白質(zhì)變性劑，能格外有效地去除蛋白質(zhì)，同時(shí)抑制了核酸酶的降解作用；三氯甲烷 帶走溶液中與質(zhì)粒DNA液相溶的少量酚由于酚的存在會(huì)干擾A260和A280的比值；有猛烈的溶脂傾向，可以溶解細(xì)胞膜，同時(shí)溶解去除脂質(zhì)類雜質(zhì)，此外具有使蛋白質(zhì)變性并分相的作用。異戊醇 ：削減泡沫的生成，以防質(zhì)粒DNA被打斷；Tris-Cl PH；〔7〕70%100%乙醇；〔8〕RnaseA：用于消化質(zhì)粒DNA溶液中的剩余RNA。抽提質(zhì)粒DNA的方法包括哪幾個(gè)步驟？細(xì)菌培育使質(zhì)粒大量擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞,并去掉細(xì)菌碎片和核質(zhì)體DNA；RNA等雜質(zhì)，分別和純化質(zhì)粒DNA。如何提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量？適當(dāng)增加菌量；所用菌不應(yīng)是長(zhǎng)期傳代的菌，由于長(zhǎng)期傳代的菌質(zhì)粒喪失比較嚴(yán)峻；重懸應(yīng)充分；裂解液應(yīng)穎；中和應(yīng)完全；用乙醇沉淀洗滌時(shí)，不用將乙醇吸的太干凈，留少量乙醇讓其自由揮發(fā)。為什么質(zhì)粒DNA不能反復(fù)在4℃、-20℃、室溫中放置？為到達(dá)這一目的，需要留意些什么？反復(fù)凍融的過(guò)程中，液固狀態(tài)的體積會(huì)發(fā)生變化，對(duì)質(zhì)DNA構(gòu)造會(huì)產(chǎn)生力學(xué)作用，導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定；反復(fù)凍融意味著反復(fù)操作，會(huì)增加引入核酸酶污染的可能性，同樣會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。試驗(yàn)二DNA的含量、純度與分子量的電泳法測(cè)定一、 試驗(yàn)原理測(cè)定核酸通常承受兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。紫外分光光度法DNA或RNA260nm280nm260nm1ug/mLDNA鈉鹽的A0.20，即在A=1DNA50ug/mLDNARNA40ug/mL，單鏈260寡核苷酸的含量為33ug/mL。雙鏈DNA＝A×50×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260RNA＝A×40×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260單鏈DNA＝A×33×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260此外還可以依據(jù)260nm280nm〔A

/A〕估量核酸的純度。瓊脂糖凝膠電泳法

260

280DNAEBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強(qiáng)度正比于DNA2－15－10ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。由于電泳時(shí)所用的樣品量格外少，只要將濃度掌握在幾十納克即可，所以在基因工程中常常被用做DNA樣品。表2－1 λDNA/HindⅢ中DNA片斷片段堿基對(duì)數(shù)目/kb相對(duì)分子質(zhì)量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.962.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6二、試驗(yàn)?zāi)康膹囊陨显囼?yàn)中提取到的質(zhì)粒DNADNA的純度、含量以及分子量大小。DNA、含量與相對(duì)分子質(zhì)量大小。三、試驗(yàn)材料和試劑材料：自制的質(zhì)粒DNA、λDNA/Hind試劑：1．標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker(λDNA/ HindⅢ)2．限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ或HindⅢ和10X緩沖液酶反響中止液：0.25％溴酚藍(lán)(40％蔗糖)，已配好。溴化乙錠染液：使用前稀釋0B應(yīng)戴好手套，并且不能將該染液灑在桌面或地面上！使用后馬上用大量的水沖洗干凈。5．0.5×TBE緩沖液：Tris2.18g1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸餾水定容至400mL。可配成5×TBE母液，使用時(shí)稀釋10倍即可。6．0.7％瓊脂糖儀器：37Eppendorf架、恒溫?fù)u床、臺(tái)式小型振蕩器、Ep管(1.5mL)、加樣器(20uL～lmL)、吸頭。四、試驗(yàn)操作〔一〕質(zhì)粒DNA1．提的質(zhì)粒，在10uL〔BamHⅠ〕進(jìn)展處理，即：質(zhì)粒DNA L10×緩沖液 1μLBamHⅠ 1μL2．37℃，保溫3-4h。31/10〔二〕瓊脂糖凝膠板的制備1．瓊脂糖凝膠的制備1.0g100mLTBE1％。2．膠板的制備將橡皮膏緊貼在有機(jī)玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。(一般稱之為梳子)，將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝室溫下靜置1h左右，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開(kāi)的樣品槽。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，參加0.5×TBE電泳緩沖液，以蓋過(guò)膠板為宜。加樣

膠板內(nèi)的樣品小槽用微量加樣器將上述樣品分別參加膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個(gè)樣品為了避開(kāi)穿插污染，各樣品用不同的吸頭，以免造成限制酶被污染。加樣時(shí)，吸頭不要插入膠板內(nèi)，防止碰壞樣品槽四周的凝膠面，10uL左右。(每塊膠板需點(diǎn)一個(gè)Marker，這里即為λDNA/HindⅢ)電泳加完樣品后應(yīng)馬上通電，進(jìn)展恒壓電泳。在低壓條件下，線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系，為了獲得電泳分別DNA片段的最大區(qū)分率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)染料〔藍(lán)色〕移動(dòng)到距離膠板下沿約1～2cm處，停頓電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EBDNA帶。染色20min后，用大量水沖洗。觀看在波長(zhǎng)為254nmDNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動(dòng)成像儀處理代替。五、留意事項(xiàng)基因工程是微量操作技術(shù)，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必需嚴(yán)格留意吸樣量的正確性，確認(rèn)樣品確實(shí)被參加反響體系。酶應(yīng)在－2020要將酶在冰浴中放置過(guò)久，或放在高于0℃以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3．酶切加樣次序?yàn)樗?、緩沖液和DNA，然后混勻。酶永久是最終參加的，如將酶直接參加濃縮的緩沖液中會(huì)引起嚴(yán)峻的失水。酶切反響體系的溶液加完后，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底，不要用振蕩器。此步操作是整個(gè)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，留意防止錯(cuò)加、漏加。4．為了避開(kāi)穿插污染，各樣品用不同的吸頭，且每次取酶時(shí)務(wù)必?fù)Q吸頭，以免造成限制酶被污染。5滴灑在臺(tái)面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、試驗(yàn)結(jié)果第一次質(zhì)粒電泳 其次次質(zhì)粒電泳BamHI酶切電泳試驗(yàn)結(jié)果分析：1、第一次質(zhì)粒電泳班級(jí)大局部同學(xué)都沒(méi)有條帶，分析可能緣由為某個(gè)公共步驟消滅問(wèn)題，進(jìn)一步探討得出可能為菌種有問(wèn)題；2、其次次質(zhì)粒電泳成功獲得質(zhì)粒條帶，但條帶亮度較弱，說(shuō)明質(zhì)粒A損失較嚴(yán)峻，可能緣由為〕重懸不充分〔2〕裂解不完全〔3〕中和不完全〔4〕用乙醇洗DNA條帶有較強(qiáng)的亮度，說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染；3、BamHI酶切質(zhì)粒所得到的電泳條帶單一、無(wú)拖尾、無(wú)彌散、亮度較強(qiáng)、點(diǎn)樣口四周亮度弱，說(shuō)明酶切效果較好，無(wú)蛋白質(zhì)污染，也說(shuō)明質(zhì)粒上BamHI酶切位點(diǎn)單一。七、思考題EB顯色的原理。解：瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)展染色，溴化乙錠含有一個(gè)可以DNA積存堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過(guò)范德華力與上下堿基相互作用這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的親熱接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA254nm302nm366nm的光輻射。這兩種狀況下，被吸取的能量在可見(jiàn)光譜紅橙區(qū)的590nm處重放射出來(lái)。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒(méi)有結(jié)合DNA20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠〔0.5ug/ml〕時(shí)，可以檢測(cè)到少至10ng的DNA條帶。使用溴化乙錠時(shí)應(yīng)留意什么？BB作環(huán)境的通風(fēng)；操作時(shí)，應(yīng)留意避開(kāi)衣服或者皮膚接觸被EB污染的試驗(yàn)臺(tái)或者其他工具；操作時(shí)所用的手套、槍頭、抹布、膠和電泳液等在試驗(yàn)完畢后都應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的處理后才能丟棄。說(shuō)明不同電壓對(duì)電泳結(jié)果的影響是什么？解：電場(chǎng)強(qiáng)度太大——泳動(dòng)速度快，易產(chǎn)生拖尾；凝膠的有效分別范圍小，不適宜分別大片段；電場(chǎng)強(qiáng)度太小——涌動(dòng)速度慢，且易產(chǎn)生彌散。如何推斷DNA的純度？〕假設(shè)點(diǎn)樣孔四周較亮，說(shuō)明樣品蛋白質(zhì)污染較嚴(yán)峻；假設(shè)在質(zhì)粒DNA下面〔遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔〕有雜帶，說(shuō)明樣品中有RNA；假設(shè)在質(zhì)粒DNA1-2條帶，說(shuō)明提取的質(zhì)粒DNA質(zhì)量不好，有斷片或者開(kāi)環(huán)。試驗(yàn)三感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、試驗(yàn)原理DNA分子。轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化的根本原理是細(xì)胞0℃，CaCl2DNADNase的羥基－鈣磷酸混合物粘附于細(xì)胞外表，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸取DNA復(fù)合物，在選擇性培育基平板上培育，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。二、試驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和理解影響細(xì)胞感受態(tài)的因素，把握感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。把握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法。把體外DNA引入受體細(xì)胞，使受體菌具有遺傳性，并從中選擇出轉(zhuǎn)化子。三、試驗(yàn)材料和用具材料：自制的質(zhì)粒DNA、大腸桿菌(E.coli)菌種(DH5α菌株)。試劑：LB(無(wú)抗生素)、LB瓊脂平板(50μg/L氨芐青霉素)、LB液體培育基5mL(無(wú)抗生素)、LB液體培育基100mL(無(wú)抗生素)、LB液體培育基5mL(50μg/L氨芐青霉素)、0.1mol/LCaCl2

溶液(滅菌備用)。儀器：恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、接種環(huán)、涂布器、冷凍離心機(jī)、離心管、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋。四、操作步驟(一)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備從活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于5mL液體培育基中，37℃振蕩培育過(guò)夜，0接種于LB℃快速振蕩培育。1.4mL培育液放入離心管中，在冰上放置10min4℃5000rpm10min。將剩余液體盡量去凈，重復(fù)步驟2。可用加樣器將剩余液體盡量去凈，用1.2mL0.1mol/LCaCl2

溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15～30min。4℃，5000rpm10min。棄上清，參加200μL0.1mol/LCaCl2

溶液，留神懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液。h％左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于Ep管中，-70℃條件下可保存半年至一年。(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)化編號(hào)編號(hào)質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞無(wú)菌水樣品12/100100/20.1mol/LCaCl2//取L搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液，進(jìn)展下一步的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化如下〔：樣品組即為我們的轉(zhuǎn)化組：100μL感受態(tài)細(xì)胞＋2μLDNA1為受體菌比照組：100μL感受態(tài)細(xì)胞＋2μL無(wú)菌水將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42℃水浴中保溫90s，然后快速在冰上冷卻3～5min。上述各管中分別參加200μLLB液體培育基，使總體積為500μL，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反響原液，搖勻后于37℃振蕩培育30min，使受體細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。(三)平板培育75μL分別接種于含氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的LB平板培育基上〔分別記為和℃培育，待菌落生長(zhǎng)良好且未相互重疊時(shí)停頓培育。(四)檢出轉(zhuǎn)化體不含抗生素培育基

含抗生素培育基

結(jié)果分析受體菌比照組轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組

有大量菌落長(zhǎng)出有大量菌落長(zhǎng)出

無(wú)菌落長(zhǎng)出有菌落長(zhǎng)出

本試驗(yàn)未產(chǎn)生抗藥性菌株質(zhì)粒進(jìn)入受體菌中產(chǎn)生抗藥性五、留意事項(xiàng)這一個(gè)試驗(yàn)中的全部操作均要為無(wú)菌操作，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)展。細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，4290s要準(zhǔn)確操作。制備感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程中，需要在冰上放置的肯定不要在室溫中放置。思考題感受態(tài)細(xì)胞制備好后，為什么在轉(zhuǎn)化前還要在冰上放置？解：細(xì)菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞會(huì)膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞外表〔DNase會(huì)消化外源DNA，如形成抗DNase的物質(zhì)有利外源A的生存，從低溫突然提高到cAMPcAMP可轉(zhuǎn)變細(xì)胞膜通透性，促使細(xì)胞吸取DNA復(fù)合物，從而大大提高轉(zhuǎn)化率。思考轉(zhuǎn)化后平板培育應(yīng)有的結(jié)果、分析自己培育的狀況。試驗(yàn)所得圖片：轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組1——含抗生素 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組1——不含抗生素轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組2——含抗生素 轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組2——不含抗生素受體菌比照組——含抗生素 受體菌比照組——不含抗生素試驗(yàn)結(jié)果：轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組中含卡拉霉素的培育基有少量的單克隆長(zhǎng)出；轉(zhuǎn)化試驗(yàn)組中不含卡拉霉素的培育基有大量菌苔長(zhǎng)出；比照組中含卡拉霉素的培育基沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)；比照組中不含卡拉霉素的培育有大量菌苔生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期全都。結(jié)果分析〕試驗(yàn)組與比照組的區(qū)分說(shuō)明，試驗(yàn)組中含卡拉霉素的培育基上有細(xì)菌生長(zhǎng)的緣由是細(xì)菌攝取了外源質(zhì)粒，而不是由于原菌液中有能抗卡拉霉素的突變菌株；試驗(yàn)組中含卡拉霉素與不含卡拉霉素的培育基的區(qū)分說(shuō)明感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率很低；比照組中含卡拉霉素與不漢卡拉霉素的培育基的區(qū)分說(shuō)明卡拉霉素沒(méi)有失活。 pH8.0G.E.T.緩沖液(滅菌后使用)：葡萄糖 0.991gEDTA-Na2

0.372gTris-HCl 0.303gHO 100mL25mol/LKAc：49.08g KAc100mLHO。2PH4.8乙酸鉀溶液：取60mL5mol/LKAc,11.5mL冰醋酸，28.5mLHO即可。2lg溶于LH。20.2mol/LHCl1.724mLHCl100mL。0Ll取l參加Ll

補(bǔ)HO至100mL即可。pH8.010mmol/LEDTA-Na：3.722gEDTA-Na

H

2O中，用固體NaOH調(diào)整其2 2 2pH值，最終定容至100mL。2pH8.0TE10mLpH8.00