凍藏溫度對(duì)低溫凍藏型草魚肌原纖維蛋白變性的影響

凍藏溫度對(duì)低溫凍藏型草魚肌原纖維蛋白變性的影響

魚肌肉的食用質(zhì)量和保存加工特性與蛋白質(zhì)的生化特性密切相關(guān)。長(zhǎng)期以來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)魚類尤其是海水魚類蛋白質(zhì)在凍藏過(guò)程中的生化特性變化和魚肌肉蛋白質(zhì)凍結(jié)變性機(jī)理進(jìn)行了大量系統(tǒng)深入的研究,取得了很多有益的成果。大量研究表明魚肌肉蛋白質(zhì)在凍藏過(guò)程中的變性與新鮮度、凍藏溫度、pH值、脂肪氧化、氧化三甲胺還原產(chǎn)生的二甲胺和甲醛等因素密切相關(guān)。其中,凍藏溫度是最重要的影響因素,凍藏溫度越低,魚肌肉蛋白質(zhì)凍結(jié)變性速度越慢。近年來(lái),鱸魚(Lateolabraxjaponicus)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,產(chǎn)量逐年遞增,目前單一的活魚銷售方式很難滿足鱸魚產(chǎn)量快速增長(zhǎng)的要求。因此,鱸魚的保鮮和加工將是水產(chǎn)加工業(yè)面臨的1個(gè)重要問(wèn)題。作者在前文中研究了鱸魚在微凍條件下的鮮度變化規(guī)律,本文將以肌動(dòng)球蛋白(MA)含量,Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性,Mg2+-EGTA-ATPase活性,巰基(-SH)含量作為蛋白質(zhì)生化特性指標(biāo),考察不同凍藏溫度對(duì)鱸魚肌肉蛋白質(zhì)生化特性的影響,以期為鱸魚的凍藏加工提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面活鱸魚(中國(guó)花鱸Lateolabraxjaponicus,海水養(yǎng)殖)購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),重量524～630g。1.2方法1.2.1蛋白質(zhì)生化特性測(cè)定活魚即殺后,將魚肉沿脊椎取下,切成2cm見(jiàn)方的魚丁,裝入保鮮袋后,分別凍結(jié)到中心溫度-10℃,-20℃,-30℃和-40℃,然后分別置于(-10±0.5)℃,(-20±0.5)℃,(-30±0.5)℃和(-40±0.5)℃下保存。每隔15d進(jìn)行1次蛋白質(zhì)生化特性指標(biāo)的測(cè)定。凍魚肉流水(15℃)解凍20min左右,然后用組織搗碎機(jī)(DS-1)搗碎,用于指標(biāo)測(cè)定。1.2.2肌動(dòng)蛋白提取按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。1.2.3肌動(dòng)球蛋白的測(cè)定采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定。1.2.4關(guān)于pma活性的測(cè)定按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行,測(cè)得的磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。1.2.5式shmol/l的計(jì)算按Benjakul等人的方法進(jìn)行。巰基含量用公式SH(mol/L)=A/c×11計(jì)算。其中A表示吸光度值,c表示分子吸光系數(shù),其值為13600/(mol/L)·cm,11表示稀釋倍數(shù)。1.2.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)1次,所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果與討論2.1凍藏過(guò)程中不同部位魚肌動(dòng)從變化到變化鱸魚在不同溫度下凍藏時(shí)肌動(dòng)球蛋白鹽溶性的變化如圖2所示。在-10℃和-20℃下凍藏時(shí)鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量一直呈快速下降趨勢(shì)。在-10℃下凍藏時(shí),前30d內(nèi)肌動(dòng)球蛋白的溶出量從21.78mg/g迅速下降到3.8mg/g,下降速率達(dá)0.599mg/g·d;在-20℃下凍藏時(shí),前60d內(nèi),肌動(dòng)球蛋白的溶出量從21.78mg/g迅速下降到2.7mg/g,下降速率達(dá)到0.318mg/g·d,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于凍藏后期的下降速率(分別為0.127mg/g·d和0.059mg/g·d)。在-10℃下凍藏時(shí),第60d的鱸魚肌肉中已幾乎提取不到肌動(dòng)球蛋白了。在-30℃和-40℃下凍藏時(shí),鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量在前30d的凍藏期內(nèi)不僅沒(méi)有下降,反而有所上升,但是變化不明顯。從第30d起,-30℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量開(kāi)始下降。在凍藏75d之后,下降速率明顯加快,達(dá)到0.576mg/g·d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束(至90d)時(shí),肌動(dòng)球蛋白的溶出量為9.16mg/g,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在-10℃和-20℃下凍藏相同時(shí)間的鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量。-40℃下凍藏的鱸魚,其肌動(dòng)球蛋白溶出量在30d之后呈緩慢下降趨勢(shì),下降速率為6.5×10-2mg/g·d。到第90d時(shí),肌動(dòng)球蛋白的溶出量仍高達(dá)到20.18mg/g,僅比鮮活魚肉的值低1.6mg/g。引起凍藏過(guò)程中肌動(dòng)球蛋白溶解性下降的因素有多種,比如由于蛋白質(zhì)的部分結(jié)合水形成冰晶而析出,導(dǎo)致肌動(dòng)球蛋白分子之間相互形成非共價(jià)鍵,進(jìn)而形成超大分子的不溶性凝集體使肌動(dòng)球蛋白溶出量下降。另外,肌原纖維蛋白變性后,會(huì)產(chǎn)生1種在高離子強(qiáng)度下不溶解但在堿液中可以溶解的蛋白質(zhì),即堿溶性蛋白質(zhì),也會(huì)導(dǎo)致肌動(dòng)球蛋白在凍藏過(guò)程中溶解性的下降。Sompongse等認(rèn)為巰基氧化形成的二硫鍵會(huì)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈的聚合,從而降低其鹽溶性。從圖2和圖7可以看出,鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量在不同溫度下凍藏時(shí)的下降趨勢(shì)與其巰基含量的變化存在相關(guān)性。因此,可以認(rèn)為鱸魚在凍藏過(guò)程中肌動(dòng)球蛋白溶出量的下降是由于巰基氧化形成二硫鍵所致。從圖2中也可清楚地看出凍藏溫度對(duì)鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量有顯著的影響。至第30d時(shí),在-10℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量已降為3.8mg/g,而在-20℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量仍高達(dá)15.91mg/g;至第60d時(shí),-20℃凍藏下的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量降至2.7mg/g,而-30℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量仍達(dá)到19.51mg/g;到第90d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),-30℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量也降至9.16mg/g,而-40℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的溶出量還保持在20.18mg/g的較高水平,差異極其顯著(p<0.01)。許多研究也得到了相似的結(jié)論。另外,從圖2中可以看到,在-30℃和-40℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量在0～30d之間均出現(xiàn)了上升趨勢(shì)。其他研究者也觀察到類似情況。筆者認(rèn)為此現(xiàn)象可能是由于提取方法不完善所致。由于在較低的溫度下凍藏時(shí)凍藏前期肌動(dòng)球蛋白變性較輕微,提取方法對(duì)實(shí)驗(yàn)值的影響較大,因而導(dǎo)致-30℃和-40℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白溶出量出現(xiàn)了上升趨勢(shì)?；诖?作者認(rèn)為不宜單獨(dú)將肌動(dòng)球蛋白的鹽溶性作為評(píng)價(jià)其變性的指標(biāo)。2.2凍藏過(guò)程中3種atpase活性的變化ATPase活性的變化鱸魚在不同溫度下凍藏時(shí)ATPase活性的變化如圖3～6所示。由圖3可知,在-10℃下凍藏的鱸魚肌動(dòng)球蛋白的Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性和Mg2+-EGTA-ATPase活性均隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降,且變化趨勢(shì)基本相似,在前30d內(nèi)下降速度非常快。尤其是前3種ATPase活性的下降速度幾乎一致。到第30d時(shí),Mg2+-EGTA-ATPase活性僅剩下0.02μmol/mg·min,到第45d時(shí),Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性也幾乎完全喪失了。從圖4可知,在-20℃下凍藏時(shí),鱸魚肌動(dòng)球蛋白的Ca2+-ATPase活性,Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性在前45d內(nèi)的下降速率較快,3種ATPase活性的下降速率基本相同。從第45d開(kāi)始,下降速率變慢。到第75d時(shí),上述3種ATPase活性已基本消失。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前15d凍藏期內(nèi)下降速率較快,從第15d開(kāi)始下降速率放慢,到第60d時(shí)活性基本喪失。從圖5可知,在-30℃下凍藏時(shí),除Ca2+-ATPase活性外,Mg2+-ATPase活性,Ca2+-Mg2+-ATPase活性大體呈均勻下降的趨勢(shì),下降速率分別為1.15×10-2μmol/mg·min·d和1.12×10-2μmol/mg·min·d。Ca2+-ATPase活性在15～45d之間存在快速下降期,下降速率達(dá)2.5×10-2μmol/mg·min·d,其他區(qū)間的下降趨勢(shì)與Mg2+-ATPase活性和Ca2+-Mg2+-ATPase活性基本相似。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前15d的下降趨勢(shì)較快,此后則基本上呈緩慢下降趨勢(shì),到第60d時(shí),Mg2+-EGTA-ATPase活性已接近0μmol/mg·min。由圖6可知,在-40℃下凍藏時(shí),鱸魚肌動(dòng)球蛋白的Mg2+-ATPase活性及Ca2+-Mg2+-ATPase活性在大體呈勻速變化趨勢(shì),它們的線性回歸方程分別為y=-0.0058x+1.134和y=-0.0057x+1.096。從回歸方程可以推知2種ATPase活性完全喪失的時(shí)間分別為195d和192d,而且可以推知實(shí)驗(yàn)結(jié)束(90d)時(shí),2種ATPase的活性分別為0.612和0.583μmol/mg·min,與實(shí)測(cè)值(0.64和0.579μmol/mg·min)基本相符。Ca2+-ATPase活性在前15d的下降趨勢(shì)較緩慢,下降速率僅為5.0×10-3μmol/mg·min·d,從第15d起開(kāi)始快速下降,下降速率提高到9.6×10-3μmol/mg·min·d。Mg2+-EGTA-ATPase活性在前30d下降非常緩慢,30～60d之間下降速率加快,此后一直緩慢下降,至第60d降為0μmol/mg·min。引起凍藏過(guò)程中魚肉肌原纖維蛋白質(zhì)ATPase活性下降的原因有多種解釋。Hatano認(rèn)為是由于冰晶的機(jī)械作用引起的;也有很多研究者認(rèn)為是由pH值下降引起的;還有許多學(xué)者認(rèn)為巰基氧化形成二硫鍵導(dǎo)致的分子聚合是ATPase活性下降的主要原因。作者認(rèn)為,由于凍藏溫度越低,pH值下降越慢,因此,在-10℃和-20℃下凍藏時(shí)鱸魚肌原纖維蛋白質(zhì)ATPase活性下降是由巰基氧化和pH值下降2個(gè)因素作用的結(jié)果,而在-30℃和-40℃下凍藏時(shí)則主要是由巰基氧化引起的。凍藏溫度對(duì)鱸魚肌原纖維蛋白質(zhì)ATPase活性下降速率存在顯著的影響。鱸魚肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-Mg2+-ATPase及Mg2+-EGTA-ATPase活性在不同凍藏溫度下的平均下降速率如表1所示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,不同凍藏溫度之間的差異極其顯著(P<0.01)。另外,在4種溫度下凍藏時(shí),Mg2+-EGTA-ATPase活性均比其他3種ATPase活性消失得更早。表明鱸魚原肌球蛋白—肌鈣蛋白復(fù)合體非常容易變性。2.3凍藏過(guò)程對(duì)身份證基含量的影響鱸魚在不同溫度下凍藏時(shí)巰基含量的變化如圖7所示。從圖7可以看出,在前15d的凍藏過(guò)程中,-10℃和-20℃下凍藏的鱸魚之間,-30℃和-40℃下凍藏的鱸魚之間,巰基含量下降速度差異不大。從第15d開(kāi)始,不同溫度下鱸魚巰基含量下降速度出現(xiàn)了顯著差異(P<0.01)。在-10℃下凍藏時(shí),鱸魚巰基含量在15～30d內(nèi)急劇下降,由0.698μmol/g下降到0.072μmol/g。在-20℃下凍藏時(shí),鱸魚的巰基含量在15～45d期間快速下降,巰基含量由0.75μmol/g下降到0.03μmol/g。在-30℃下凍藏時(shí),鱸魚巰基含量下降速度從第15d開(kāi)始突然加快,第60d后逐漸減慢。到第90d時(shí),巰基含量仍達(dá)0.41μmol/g。在-40℃下凍藏時(shí),鱸魚巰基含量在前45d幾乎不變,而后以極為緩慢的速度下降。到90d的凍藏期結(jié)束時(shí),巰基含量依然高達(dá)0.814μmol/g,比初始含量下降了0.331μmol/g,平均下降速率僅為3.7×10-3μmol/g·d。巰基含量在凍藏過(guò)程中下降的原因可能是冰晶的形成使得肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái),進(jìn)而被氧化成二硫鍵,導(dǎo)致巰基含量的減少。凍藏溫度對(duì)鱸魚巰基含量的變化影響極其顯著。凍藏至第30d時(shí),-10℃下