抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定試劑盒說明書

第第頁抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定試劑盒說明書抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預期差異大的樣本做預測定。測定意義：APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關鍵酶之一、APX具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質、線粒體、過氧化物和乙醛酸體，以及過氧化體和類囊體膜上。APX催化H2O2氧化AsA，是植AsA的主要消耗者。APX的活性直接影響到AsA的含量，APX與AsA具有一定的負相關性。測定原理：APX催化H2O2氧化AsA，通過測定AsA氧化速率，來計算得APX活性。自備儀器用品：低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。試劑組成和配制：試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保存。試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加3mL蒸餾水充分溶解。試劑三：液體3mL×1支，4℃保存。粗酶液提取：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。測定：1.分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長到290nm，用蒸餾水調零。2.試劑一在25℃中預熱30min。3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL預熱的試劑一20μL試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后在290nm測定10s和130s光吸收A1和A2，△A=A1A2.APX活性計算：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmolAsA為1個酶活單位。APX(nmol/min/mgprot)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T=1786×△A÷Cpr（2）按樣本質量計算活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmolAsA為1個酶活單位。APX(nmol/min/g鮮重)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1786×△A÷Wε：AsA在290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×103L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×104L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：催化反應時間（min），2min。b.使用96孔板測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmolAsA為1個酶活單位。APX(nmol/min/mgprot)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T=3571×△A÷Cpr（2）按樣本質量計算活性單位定義：每g組織每分鐘氧化1nmolAsA為1個酶活單位。APX(nmol/min/g鮮重)=△A÷(ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3571×△A÷Wε：AsA在290nm處摩爾吸光系數(shù)為2.8×103L/mol/cm；d：96孔板光徑（cm），0.5cm；V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×104L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W：樣品質量；V樣：加入反應體系中上