免疫細(xì)胞的分離技術(shù)教學(xué)課件

免疫細(xì)胞的分離12023/12/3免疫細(xì)胞1、概念

直接參與免疫應(yīng)答及與免疫應(yīng)答相關(guān)的所有細(xì)胞。2、分類

＊單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)：單核細(xì)胞/

巨噬細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞（DCs)＊淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：T淋巴細(xì)胞（Th/Tc) B淋巴細(xì)胞NK細(xì)胞

＊粒細(xì)胞系統(tǒng):中性粒細(xì)胞 噬酸性粒細(xì)胞 噬堿性粒細(xì)胞22023/12/3免疫細(xì)胞的分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的分離免疫細(xì)胞亞群的分離32023/12/3細(xì)胞分離原理細(xì)胞的大小和比重細(xì)胞表面標(biāo)志細(xì)胞黏附于各種物質(zhì)表面的特性42023/12/3

一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

——Ficoll分層離心法人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte。原理：血液中各細(xì)胞成分的比重不同，經(jīng)離心沉淀，即可在分層液與血漿之間獲得比較純的單個(gè)核細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞占90%以上。

52023/12/3不同細(xì)胞密度不同

紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞1.092

單個(gè)核細(xì)胞1.070

分層液1.077

62023/12/3一、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

——Ficoll分層離心法

Ficoll分層液：蔗糖聚合物+泛影葡胺，密度1.077+0.001g/L。72023/12/3二、淋巴細(xì)胞的分離

尼龍棉柱法E花環(huán)分離法補(bǔ)體細(xì)胞毒法免疫熒光法

82023/12/3二、淋巴細(xì)胞的分離

——尼龍棉柱法原理：B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易黏附的特性，將淋巴細(xì)胞懸液加至尼龍纖維柱上，37℃作用1~2h后，洗脫的為非黏附性的T細(xì)胞。PBMC尼龍纖維棉柱B細(xì)胞單核細(xì)胞T細(xì)胞92023/12/3二、淋巴細(xì)胞的分離

—E花環(huán)分離法（純化T細(xì)胞）原理＊成熟T細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體（E受體，CD2分子），可和SRBC形成E花環(huán)，B細(xì)胞則無。

＊E花環(huán)比重大，沉淀，經(jīng)分離液分離來。

＊

E花環(huán)周圍的綿羊RBC可用低滲法除去。10三、免疫細(xì)胞亞群的分離免疫磁珠分離法流式細(xì)胞術(shù)112023/12/3三、免疫細(xì)胞亞群的分離

—免疫磁珠分離法原理：將抗體交聯(lián)于磁珠表面形成免疫磁珠（Immunomagneticbead，IMB），免疫磁珠直接或者間接偶聯(lián)在抗體上，從而與細(xì)胞相連，

在高強(qiáng)度、梯度磁場中達(dá)到細(xì)胞磁性分離的目的。2023/12/312免疫細(xì)胞的分離12三、免疫細(xì)胞亞群的分離

—免疫磁珠分離法1.直接法：

抗細(xì)胞表面分子抗體+磁性微球

免疫磁珠+細(xì)胞懸液

與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞2.間接法：

第二抗體+磁性微粒

第一抗體+細(xì)胞

特定細(xì)胞131415免疫磁珠法分選裝置16三、免疫細(xì)胞亞群的分離

—流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）FCM將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。原理：細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)。當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴處流出時(shí)，超聲震動液流，使液流段裂成一連串的均勻小滴，每個(gè)小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞類型。172023/12/3流式細(xì)胞儀工作原理182023/12/3流式細(xì)胞儀192023/12/3免疫細(xì)胞的分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離——Fico