第二章-預(yù)處理技術(shù)課件

2.1概述生物材料的預(yù)處理過程一般有以下幾個步驟：①動物組織和器官要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，然后絞碎，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┬纬杉?xì)胞懸液。②植物組織和器官要先去殼、除脂，再粉碎，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┬纬杉?xì)胞懸液。③發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織分泌液以及制成的細(xì)胞懸液等則根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物所處位置不同進(jìn)行相應(yīng)的處理。發(fā)酵液預(yù)處理的目的和內(nèi)容②相對純化。發(fā)酵液預(yù)處理的主要目的：*發(fā)酵液預(yù)處理的主要包括：①改變發(fā)酵液(培養(yǎng)液)的物理性質(zhì)，以利于固－液分離。主要方法有加熱、調(diào)整pH、凝聚和絮凝。②去除發(fā)酵液(培養(yǎng)液)中部分雜質(zhì)，以利于提取和精制后繼各工序的順利進(jìn)行。①發(fā)酵液過濾特性的改變；2.1發(fā)酵液過濾特性的

改變與相對純化

這些特性使得發(fā)酵液的過濾與離心相當(dāng)困難微生物發(fā)酵液的特性為：①發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，懸浮液中大部分是水；②懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；③固體粒子可壓縮性大；④液相粘度大，大多為非牛頓型流體；⑤性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響⑥成分復(fù)雜，雜質(zhì)較多。一、改善發(fā)酵液過濾特性的方法：1.降低液體黏度2.調(diào)整pH3.加入反應(yīng)劑4.加入助濾劑5.凝聚6.絮凝常用的方法有加水稀釋法和加熱法。加水稀釋法會加大后續(xù)過程的處理任務(wù)。1.降低液體黏度注意事項(xiàng)：嚴(yán)格控制加熱溫度與時間。首先，加熱的溫度必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性變質(zhì)的范圍內(nèi)；其次，溫度過高或時間過長，會使細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一，方法簡單有效、成本低廉。如利用酸堿性來調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)達(dá)到等電點(diǎn)得以除去。又如過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染。2.調(diào)整pH3.加入反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑可和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體黏結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠體物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。助濾劑的微粒大小、粒度分布及添加量對過濾速度影響很大。4.加入助濾劑助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。常有的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入發(fā)酵液，也可兩種方法同時使用。在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。二、發(fā)酵液的相對純化1.高價無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）2.雜蛋白在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力；在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清；（一）高價無機(jī)離子的去除方法2.Mg2+——三聚磷酸鈉(Na5P3P10)→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物1.Ca2+——草酸、草酸鈉→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

3.Fe2+——黃血鹽(K4Fe(CN)6)

→普魯士藍(lán)沉淀（二）雜蛋白的去除方法1.沉淀法2.變性法3.吸附法在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu++、Zn++、Fe+++和Pb++等形成沉淀。1.沉淀法2.變性法加熱，大幅度調(diào)節(jié)pH值，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等。不足之處加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。第三節(jié)凝聚與絮凝凝聚——是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細(xì)胞，菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程。一、凝聚概念原理：發(fā)酵液(培養(yǎng)液)中細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面都帶有同種電荷，使得這些膠體粒子之間相互排斥，保持一定距離而不互相凝聚。另外，這些膠體粒子和水有高度的親和性，其表面很容易吸住水分，形成一層水膜，從而使膠體粒子呈分散狀態(tài)。在發(fā)酵液(培養(yǎng)液)中加入電解質(zhì)，就能中和膠體粒子的電性，奪取膠體粒子表面的水分子，破壞其表面的水膜，從而使膠體粒子能直接碰撞而聚集起來。一、凝聚陽離子對帶負(fù)電荷的凝膠凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

無機(jī)鹽類：金屬氧化物類：Al2(SO4)3.18H2O(明礬)、AlCl3.6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等(2)常用的凝聚劑

絮凝——指使用絮凝劑(通常是天然或合成的大相對分子質(zhì)量物質(zhì))，在懸浮離子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程。二、絮凝概念絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如---COOH）或陽離子（如---NH2）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架連接時，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。二、絮凝絮凝作用示意圖必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團(tuán)，但相對分子質(zhì)量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，使之能和膠粒表面相結(jié)合；2.對絮凝劑化學(xué)結(jié)構(gòu)的一般要求1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：3.常用的絮凝劑目前最常見的高分子聚合物絮凝劑:有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺衍生物根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）3.常用的絮凝劑聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計量；絮凝體粗大，分離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。4.絮凝的影響因素攪拌速度和時間：初期高速，接著應(yīng)延長攪拌時間，降低攪拌速度。絮凝體的濃度：最佳添加量往往需通過實(shí)驗(yàn)確定溶液的pH：通過實(shí)驗(yàn)確定絮凝劑的相對分子質(zhì)量：要適當(dāng)?shù)矸勖赴l(fā)酵液中對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。三、混凝對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理；第四節(jié)細(xì)胞破碎

一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)二、細(xì)胞破碎率效果的檢驗(yàn)三、細(xì)胞破碎的方法四、選擇破碎方法的依據(jù)五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。概念一、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。1.微生物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；2.植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)成熟的植物細(xì)胞壁分為初生壁和次生壁，次生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成時，細(xì)胞不再增大。初生壁與次生壁的主要化學(xué)成分均為纖維素。纖維素分子又可進(jìn)一步組裝成微纖絲，微纖絲再交織成網(wǎng)狀，就構(gòu)成細(xì)胞壁的基本骨架。在使用酶法和化學(xué)法溶解細(xì)胞時，細(xì)胞壁的組成最重要，其次是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。3.細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的破碎在機(jī)械破碎中，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞壁的厚度和聚合物的交聯(lián)程度是影響破碎難易程度的重要因素。細(xì)胞個體小、呈球形、壁厚、聚合交聯(lián)程度高則難破碎。二、細(xì)胞破碎效果的檢查

破碎率定義:被破碎的細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，即其中N0：原細(xì)胞數(shù)，N：破碎后殘存的正常細(xì)胞。N0和N的可通過直接測定法、目的產(chǎn)物測定法和測定導(dǎo)電率得到。1.直接測定法顯微鏡計數(shù)相對快速簡單，采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。方法：樣本適當(dāng)稀釋后，通過平板計數(shù)技術(shù)或在血球計數(shù)板上用顯微鏡觀察來實(shí)現(xiàn)染色細(xì)胞的技術(shù)。平板計數(shù)法計數(shù)時間長；只有活細(xì)胞才被計數(shù)，誤差大；細(xì)胞聚集時，不利計數(shù)。2.目標(biāo)產(chǎn)物測定法Rm：理論最大值，R：實(shí)驗(yàn)測得值。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計算其破碎率。3.測定導(dǎo)電率細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。導(dǎo)電率的大小取決于微生物的種類、處理的條件、細(xì)胞的濃度、溫度和懸浮液中原電介質(zhì)的含量等，因此，正式測定前，應(yīng)預(yù)先用其它方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、細(xì)胞破碎的方法（按細(xì)胞所受作用）高壓勻漿法珠磨法超聲破碎法滲透壓法反復(fù)凍融法干燥法X-press法1.物理破碎(1)高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：進(jìn)口出口高壓均漿法中影響細(xì)胞破碎的因素主要有壓力、循環(huán)操作次數(shù)和溫度。一般來說，增大壓力和增加破碎次數(shù)可提高破碎率，但當(dāng)壓力增大到一定程度后對均漿器的磨損較大，工業(yè)生產(chǎn)中常用55～70MPa的壓力。對于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。破碎率隨溫度的增加而增加，但高溫破碎只適用于非熱變性產(chǎn)物。高壓勻漿法中影響細(xì)胞破碎的因素:不宜采用高壓勻漿法的微生物：

易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。

進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。(2)珠磨法（Beadmill）①工作原理：臥式實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。②影響細(xì)胞破碎的因素b.珠體的裝量a.珠體的大小c.攪拌速度d.操作溫度e.被處理細(xì)胞的特性實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，珠徑0.2mm，工業(yè)規(guī)模珠徑大于0.4mm80～90％適當(dāng)5～40℃珠磨法的破碎率一般控制在80％以下其原理可能與空穴現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。3.超聲破碎法（Ultrasonication）超生波破碎細(xì)胞時的頻率一般為15～20kHz，功率為100～250W，可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)式兩種型式。（3）超聲波破碎法影響超生波破碎的因素主要有超聲波的聲強(qiáng)、頻率、破碎時間、介質(zhì)的離子強(qiáng)度、pH、菌體的濃度和種類。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時細(xì)胞濃度一般在20％左右。（3）超聲波破碎法超聲波破碎法在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用較廣。操作時常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷卻到0～5℃，并且還應(yīng)在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。另外，超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活?？梢酝ㄟ^添加自由基清洗劑如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氫氣預(yù)吹細(xì)胞懸浮液來緩和。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。（4）滲透壓沖擊法（Osmoticpressure）僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。（5）反復(fù)凍融法適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。（6）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25～30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌；冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì)。

此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔擠出，由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而破碎。（7）X-press法該法主要用于實(shí)驗(yàn)室，具有使用范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)。不適用于對冷凍敏感的物質(zhì)。酶溶法化學(xué)試劑破碎法外加酶法自溶法表面活性物質(zhì)EDTA螯合劑有機(jī)溶劑變性劑2.化學(xué)破碎（Chemicalpermeation）（1）酶溶法（EnzymaticLysis）①外加酶法常用的溶酶G+

溶菌酶、適量抑制劑G-溶菌酶、EDTA放線菌溶菌酶酵母菌β-葡聚糖酶霉菌幾丁質(zhì)酶、植物纖維素酶、半纖維素酶細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：酶溶法的缺點(diǎn)：缺點(diǎn)是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。（2）自溶法（Autolysis）誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法和干燥法。影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、緩沖液濃度和細(xì)胞代謝途徑等。某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。（2）化學(xué)試劑破碎法（Chemicalpermeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

用堿處理細(xì)胞，可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸。如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫等也可使細(xì)胞破碎。表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。處理G-細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。EDTA螯合劑能溶解細(xì)胞壁中的磷脂層，使細(xì)胞破壞。有機(jī)溶劑變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是常用的變性劑。常用的有機(jī)溶劑：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高級醇等。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50%有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)法的優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。細(xì)胞破碎方法（按是否使用外加作用力）細(xì)胞破碎方法：機(jī)械法非機(jī)械法缺點(diǎn)：固－液分離較困難。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備通用性強(qiáng)、破碎率高、操作時間短、成本低、大多數(shù)方法適于大規(guī)模生產(chǎn)。缺點(diǎn)：破碎率低、耗時、成本高、一般適合小規(guī)模生產(chǎn)。優(yōu)點(diǎn)：固－液分離容易。選擇破碎方法時，需要考慮下列因素：四、選擇破碎方法的依據(jù)1.處理量的大小2.細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)3.目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性4.破碎后固－液分離的難易程度適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步提取這三方面權(quán)衡。五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向1.多種破碎方法相結(jié)合2.與上游技術(shù)相結(jié)合培養(yǎng)過程控制3.與下游技術(shù)相結(jié)合寄主細(xì)胞的選擇包含體的組成耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)克隆噬菌體溶解基因第五節(jié)離心技術(shù)離心分離離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心力場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。優(yōu)點(diǎn)：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好。缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。一、離心分離的基本原理當(dāng)物體圍繞一中心軸做圓周運(yùn)動時，運(yùn)動物體就受到離心力的作用。旋轉(zhuǎn)的速度越高，運(yùn)動物體所受到的離心力越大。如果裝有懸浮液或高分子溶液的容器進(jìn)行高速水平旋轉(zhuǎn)，在相同轉(zhuǎn)速條件下，容器中不同大小的懸浮顆?；蚋叻肿尤苜|(zhì)會以不同的速率沉降。定義：顆粒在單位離心力場中移動的距離。相對離心力（Relativecentrifugalforce）（RCF）是指在離心場中作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)。相對離心力：RCF=rω2/g

=∏2n2r/900g

1.離心力與相對離心力定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的。s=2.303(lgx2-lgx1)/ω2(t2-t1)

2.沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）定義：在離心力下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動的距離。3.沉降速度4.沉降時間t2-t1=lnr2/r1/sω2

定義：離心分類機(jī)轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的懸浮液或乳濁液在離心場中所受的離心力與其重力的比值，即離心加速度與重力加速度的比值。5.分離因數(shù)Fr=Rω2/g=∏2Rn2/900g

分離分離時，要根據(jù)所分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小、密度和特性的不同選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。二、離心分離純化的分法差速離心法速率區(qū)帶離心法等密度離心法（1）差速離心法通過控制不同的離心力和離心時間，使沉降速度不同的顆粒逐級分離的方法。操作時選用懸浮液來進(jìn)行分離，先選擇好離心力和離心時間，使懸浮液中最大的顆粒先沉淀，取出上情液，然后加大離心力再進(jìn)行分離，沉淀出較小的顆粒，如此多次分離，達(dá)到逐級分離的目的。（1）差速離心法差速離心法的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不易分開，常用于粗制品的提取，如細(xì)胞均漿中細(xì)胞器的分離。（2）速率區(qū)帶離心法也稱一般密度梯度離心法，是在離心管中事先加入某種低分子溶液(蔗糖、甘油等)，調(diào)配好密度梯度，在密度梯度溶液得頂部加待處理得樣品，然后離心，使沉降系數(shù)比較接近得物質(zhì)得以分離得一種區(qū)帶分離方法。梯度介質(zhì)不與目的組分反應(yīng)，不引起分離組分得變性、失活。用于形成密度梯度介質(zhì)很多，較常用得是蔗糖、甘油、硅膠等。步驟：

1)在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐步增加（正

梯度）

2)將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成

一負(fù)梯度。

3)由于不同大小的粒子在離心力作用下梯度中移動的速度不一樣，所有經(jīng)過離心后，會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

速率區(qū)帶離心法（3）等密度離心法是欲分離的物質(zhì)顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，在離心力作用下，不同密度的顆粒向上或向下移動，直到顆粒的浮力密度與梯度密度相等，形成區(qū)帶。常用介質(zhì)一般為CsCl、KBr、NaI等，首先