蛋白質(zhì)印跡法westernblot應用介紹課件

WesternBlot介紹WesternBlot一般流程WesternBlot常見問題分析WesternBlot介紹蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認為是美國斯坦福大學的喬治·斯塔克（GeorgeStark）。在尼爾·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析生物化學》（AnalyticalBiochemistry）中首次被稱為WesternBlot。蛋白免疫印跡(WesternBlot)是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，現(xiàn)己廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。WesternBlot流程（1）貼壁細胞蛋白樣品收集A收集培養(yǎng)瓶或六孔板中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中。B加入PBS沖洗2-3遍，再將PBS轉(zhuǎn)移至離心管中，離心收集細胞。C將細胞培養(yǎng)瓶或六孔板置于冰上，然后將離心好的離心管中的液體小心傾盡并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂解液200μl于離心管中并移至對應的培養(yǎng)瓶中，搖晃培養(yǎng)瓶使裂解液與貼壁的細胞充分接觸，冰上裂解30min。D裂解結(jié)束后用細胞刮將貼壁的細胞刮下并轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，再用超聲破碎儀破碎細胞后，4℃下12000rpm離心15min，吸取上層液體于新的離心管中，棄掉沉淀。

收集蛋白樣品

(Proteinsamplepreparation)分多次將細胞收至一個管中（2）．蛋白含量測定（福林-酚法

）目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍法）、Lowry法（福林-酚試劑法）、BCA法等。1、配制BSA標準溶液：0、25、50、100、150、200、300μg/mL（用PBS配制）。樣品液：取原液2μL至200μL（用PBS配制）。2、操作：先取一塊新的96孔板，于630nm下測光密度值，取溶液/樣品40μL和E液40μL，每個濃度點均作三復孔，振蕩混勻。37°C反應10min后，加入福林酚試劑（1:15稀釋）160μL，振蕩混勻，37°C反應30min。630nm下測光密度值。以標準蛋白濃度對光密度值作出標準曲線，計算待測樣品蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠濃度與蛋白分離范圍1、配制下層膠（分離膠）靜置1h后制上層膠（濃縮膠）2、配制上層膠（濃縮膠）加完后插上梳子，靜置1h(1)SDS凝膠配制

制膠操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。加完分離膠后膠，加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。分離膠充分凝固就倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。插梳子時要使梳子保持水平。制膠過程注意事項：(2)上樣與電泳

將制備好的樣品溶解后，把蛋白樣品直接上樣到SDS膠加樣孔內(nèi)即可。跑上層膠，70V35Ma/塊45min；跑下層膠，100V35Ma/塊膠1h左右。轉(zhuǎn)膜(Transfer)半干轉(zhuǎn)移法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣夾在用緩沖液濕潤濾紙間。

－|紙|膠|膜|紙|＋槽式濕轉(zhuǎn)法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中。

－|海綿|紙|膠|膜|紙|海綿|＋轉(zhuǎn)膜注意事項濾紙、膠、膜之間不能有氣泡。濾紙、膠、膜的大小和擺放順序。膠和膜上要做好標記，識別正反面和上下。PVDF膜需要100%甲醇預處理，后續(xù)操作中膜必須保持濕潤。轉(zhuǎn)膜條件：推薦：100V，1—2小時；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）麗春紅染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標記抗體或放射性標記A蛋白探針的Western印跡過程。封閉(Blocking)將轉(zhuǎn)印膜浸泡到封閉液中，將膜上沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的區(qū)域結(jié)合上蛋白質(zhì)，目的是使抗體與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合。封閉液5%

TBST脫脂奶粉溶液（30ml）牛血清白蛋白溶液(BSA)

搖床上緩慢搖動封閉，室溫2h或4℃過夜。Tween-20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗原的結(jié)合。一抗孵育

(Primaryantibodyincubation)

把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當?shù)姆跤郎囟群蜁r間。

回收一抗。加入TBST液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通?？梢赃x用Tubulin抗體或Actin抗體，進行內(nèi)參檢測。二抗孵育

(Secondaryantibodyinucubation)

NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，加入稀釋好的熒光二抗，37℃緩慢搖動孵育一小時。二抗需根據(jù)一抗進行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗。

回收二抗。加入TBST液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。蛋白檢測

(Detectionofproteins)

DAB顯色法

ECL顯色原理：(二抗用HRP標記)反應物為過氧化物+魯米諾，如果遇到HRP即發(fā)光，可使膠片曝光顯影?；瘜W發(fā)光顯色法(ECL)ECL化學發(fā)光顯色

比較常用，結(jié)果容易控制，但是被催化是靈敏度差一點DAB顯色

比較靈敏，是HRP最敏感的底物電解質(zhì)電解質(zhì)可促進抗原抗體復合物的形成，因此常選用各種緩沖液做為抗體的稀釋液。酸堿度抗原抗體反應需要適宜的pH值環(huán)境，一般為pH6.0-8.0。溫度溫度升高可使反應加速，但溫度高于56℃時，可導致抗原抗體的解離，甚至變性。影響抗原抗體反應的因素膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊對策背景太高抗體濃度過高封閉不充分膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應

原因?qū)Σ唠s交前檢測一抗、二抗的工作濃度延長封閉時間或更換封閉液轉(zhuǎn)膜前用甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應非特異條帶多抗體濃度過高膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應

原因?qū)Σ唠s交前檢測一抗、二抗的工作濃度轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應

蛋白帶型條狀上樣過量樣品沉淀樣品中的污染制膠不佳

原因?qū)Σ呓档蜕蠘恿考哟髽悠分械腟DS濃度離心樣品確保灌膠均勻

條帶模糊蛋白樣品部分變性蛋白樣品部分還原電泳時間過長

原因?qū)Σ咄耆冃缘鞍状_保加入足夠的DTT或β-巰基乙醇觀察指示劑染料，