單底物酶促反應(yīng)

第一節(jié)動(dòng)力學(xué)方程推導(dǎo)酶反響的根本動(dòng)力學(xué)關(guān)系，是指酶反響速度與酶和底物間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系。由于酶和底物是構(gòu)成酶反響系統(tǒng)最根本的因素，它們打算酶反響的根本性質(zhì)、酶反響的速度規(guī)律，而其他各種因素也正是通過(guò)它們產(chǎn)生影響的；而且，這種動(dòng)力學(xué)關(guān)系是整個(gè)酶反響動(dòng)力學(xué)的根底。描寫(xiě)這種根本動(dòng)力學(xué)關(guān)系的是米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmax[S]/(Km+[S])酶促反響速度的測(cè)定與酶的活力單位1、測(cè)定酶促反響的速度必需測(cè)初速度2、酶活力3、酶活力的表示方法4、酶活力測(cè)定方法：終點(diǎn)法動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)酶含量及存在，很難直接用酶的“量”〔質(zhì)量、體積、濃度〕來(lái)表示，而常用酶催化某一特定反響的力量來(lái)表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化肯定化學(xué)反響的力量稱酶活力，酶活力通常以最適條件下酶所催化的化學(xué)反響的速度來(lái)確定。酶活力測(cè)定方法終點(diǎn)法:酶反響進(jìn)展到肯定時(shí)間后終止其反響，再用化學(xué)或物理方法測(cè)定產(chǎn)物或反響物量的變化。動(dòng)力學(xué)法:連續(xù)測(cè)定反響過(guò)程中產(chǎn)物\底物或輔酶的變化量，直接測(cè)定出酶反響的初速度。

酶活力的表示方法活力單位〔activeunit〕習(xí)慣單位〔U〕:底物(或產(chǎn)物)變化量/單位時(shí)間國(guó)際單位〔IU〕:1μmoL變化量/分鐘Katal〔Kat〕：1moL變化量/秒比活力=總活力單位總蛋白mg數(shù)=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小轉(zhuǎn)換系數(shù)〔Kcat〕底物〔μmoL〕/秒·每個(gè)酶分子量度酶純度比活力〔specificactivity〕量度轉(zhuǎn)換效率各種因素對(duì)酶反響速度的影響2、底物濃度3、pH〔最適pH的概念〕4、溫度〔最適溫度的概念〕5、激活劑6、抑制劑1、酶濃度當(dāng)S足夠過(guò)量，其它條件固定且無(wú)不利因素時(shí)，v=k[E]底物濃度對(duì)酶反響速度的影響酶反響速度與底物濃度的關(guān)系曲線〔Michaelis—Menten曲線〕米氏方程的提出及推導(dǎo)米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的測(cè)定單分子酶促反響的米氏方程及Km推導(dǎo)原則：從酶被底物飽和的現(xiàn)象動(dòng)身，依據(jù)“穩(wěn)態(tài)平衡”假說(shuō)的設(shè)想進(jìn)展推導(dǎo)。米氏方程:米氏常數(shù):酶反響速度與底物濃度的關(guān)系曲線米氏方程的推導(dǎo)令：將〔4〕代入〔3〕，則：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：則：(1)經(jīng)整理得：由于酶促反應(yīng)速度由[ES]決定，即，所以(2)將（2）代入（1）得：(3)當(dāng)酶反應(yīng)體系處于恒態(tài)時(shí)：當(dāng)[Et]=[ES]時(shí)，(4)所以

其次節(jié)米氏方程的爭(zhēng)論一、米氏方程的特性二、米氏方程中v和[S]的關(guān)系當(dāng)v＝Vmax時(shí)，v與[S]無(wú)關(guān)，只和[E0]成正比，這時(shí)說(shuō)明酶的活性局部已全部被底物占據(jù)。當(dāng)v＝0.5Vmax時(shí)，表示活性部位有一半被占據(jù)。當(dāng)一個(gè)酶的Km，則任何底物濃度下酶活性部位被占據(jù)的分?jǐn)?shù)：Ys=vVmax=[S]Km+[S]稱為該酶促反響的相對(duì)速度。米氏方程所作曲線的曲度，不隨Km和Vmax的變化而變化。所以任何酶只要聽(tīng)從米氏方程。則到達(dá)任何兩個(gè)Vmax分?jǐn)?shù)的對(duì)應(yīng)底物濃度之比為一常數(shù)。例如：∴[S]0.9=9Km，同理[S]0.1=1/9Km，所以：[S]0.9/[S]0.1＝9Km/1/9Km＝81，即達(dá)90％Vmax與達(dá)10％Vmax所需底物濃度之比總是81。同樣也可得到達(dá)70％Vmax與達(dá)10％Vmax所需底物濃度之比總是21。在酶促反響初速度區(qū)即在一級(jí)速度區(qū)，由于[S]<<Km，∴v=Vmax[S]/Km=k[S]。從這個(gè)方程可知，一級(jí)速度常數(shù)k=Vmax/Km。0.9VmaxVmax=[S]0.9Km+[S]0.9k的物理意義：底物在單位時(shí)間轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的量。例如k=0.02min-1，就意味著底物在一分鐘內(nèi)會(huì)有2％轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物；假設(shè)k＝2.3min-1＝0.0383sec-1，那就意味著每秒鐘有3.83％的底物變成產(chǎn)物。要測(cè)定任一時(shí)間范圍內(nèi)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量，可用一級(jí)速度方程積分。得：lg[S]=-kt/2.3+lg[St]第三節(jié)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

—分析酶促反響速度的作圖法一、Lineweaver-Burk法(雙倒數(shù)作圖法)將試驗(yàn)所得的一些初速度數(shù)據(jù)v和[S]取倒數(shù)，得各種1/v和1/[S]，將1/v對(duì)1/[S]作圖，得始終線。該直線縱截距＝1/Vmax，斜率＝Km/Vmax，橫截距＝-1/Km。應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)求Km和Vmax等動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較便利，也是最廣泛應(yīng)用的一種方法，但欲要獲得較準(zhǔn)確的結(jié)果，試驗(yàn)時(shí)必需留意底物濃度范圍，一般所選底物濃度需在Km四周。1.以下圖是依據(jù)[S]在0.33～2.0Km范圍時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果而作的雙倒數(shù)圖，從今圖可準(zhǔn)確地測(cè)量出-1/Km和1/Vmax等。[S]在0.33～2.0Km的范圍的試驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。2.假設(shè)所選底物濃度比Km大得多，則所得雙倒數(shù)圖的直線根本上是水平的。這種狀況雖可測(cè)得1/Vmax，但由于直線斜率近乎零，-1/Km則難以測(cè)得。[S]在3.3～20Km的范圍的試驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。3.假設(shè)[S]比Km小得多，則所作雙倒數(shù)圖的直線與兩軸的交點(diǎn)都接近原點(diǎn)，使-1/Km和1/Vmax，都難以測(cè)準(zhǔn)。[S]在0.033～0.2Km的范圍的試驗(yàn)結(jié)果而作出的雙倒數(shù)圖。二、其它線性作圖法1.Hanes-Woolf作圖法即把米氏方程重排成線性方程2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作圖法將米氏方程重排為線性方程：3.Eadie-Scatchard作圖法將米氏方程重排為線性方程以上三種作圖法也應(yīng)留意選擇底物濃度，不要使[S]比Km高得多或低得多。上述幾種線性作圖法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。雙倒數(shù)作圖法應(yīng)用最廣泛。但此法有兩個(gè)缺點(diǎn)：第一，在v～[S]圖上，由相等增值而給出的等距離各點(diǎn)，在雙倒數(shù)圖上變成非等距離的點(diǎn)，且多數(shù)點(diǎn)集中在1/v軸四周，而遠(yuǎn)離1/v軸的地方只有少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)，恰好這些點(diǎn)又正是主觀目測(cè)以確定直線最權(quán)重的那些點(diǎn)。其次，在測(cè)定v時(shí)產(chǎn)生的小誤差，當(dāng)取倒數(shù)時(shí)會(huì)放大。在低底物濃度下更為敏感，因在高1/[S]值所得的一兩個(gè)不準(zhǔn)確的點(diǎn)，會(huì)給圖的斜率帶來(lái)顯著誤差。第一個(gè)缺點(diǎn)可通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)腫S]，使1/[S]為等距離增值而得到抑制。對(duì)其次個(gè)缺點(diǎn)關(guān)鍵要留意在低底物濃度下使所測(cè)初速度誤差盡可能減小。[S]/v對(duì)[S]作圖，[S]未取倒數(shù)。另兩個(gè)線性作圖法，v未取倒數(shù)。前者對(duì)等距離[S]增值所測(cè)數(shù)據(jù)作圖較雙倒數(shù)法更優(yōu)越。后者在低底物濃度下測(cè)定誤差較大時(shí)使用，比其它方法更牢靠。三、Eisenthal-Cornish-Bowden作圖法這是依據(jù)米氏方程的性質(zhì)而提出的一種直接作圖法。該法是把[S]值標(biāo)在橫軸的負(fù)半軸上，而把測(cè)得的v值標(biāo)在縱軸上，然后把相應(yīng)的v和[S]連成直線，這樣所得的一簇直線交于一點(diǎn)，該交點(diǎn)坐標(biāo)為Km和Vmax。四、米氏方程的積分形式及其對(duì)數(shù)據(jù)的處理米氏方程是一個(gè)微分方程，其v=d[P]/dt或v=-d[S]/dt。依據(jù)從米氏方程重排得到的線性方程作圖求Km和Vmax時(shí)，在試驗(yàn)過(guò)程中所取數(shù)據(jù)必需限于初速度階段，即只能是小于5％的[St]轉(zhuǎn)變?yōu)閇P]的階段。但有些狀況，例如，產(chǎn)物濃度過(guò)低難以測(cè)定；或產(chǎn)物根本不能直接測(cè)定，而必需測(cè)定底物濃度的降低來(lái)反映產(chǎn)物的量(即[P]＝[St]-[S])。假設(shè)只限于5％的底物發(fā)生反響就難以測(cè)準(zhǔn)其降低的量。在這些狀況下，如用積分速度方程處理，就不受這種限制。例如，在10％～90％的[St]轉(zhuǎn)變?yōu)閇P]的數(shù)據(jù)均可使用。由于積分方程在反響全過(guò)程中都是準(zhǔn)確的。最簡(jiǎn)潔的積分方程是在假定無(wú)產(chǎn)物抑制(即Kms<<Kmp)，并且Keq很大的狀況下導(dǎo)出:重排成各種線性形式，如可直接測(cè)得Vmax/Km和Vmax，從而可算出Km，這樣的處理方法，可從比Km大幾倍的[St](如[St]＝10Km)開(kāi)頭，將反響進(jìn)展到[S]顯著低于Km(如[S]=0.1Km)止。五、Lee和Wilson改進(jìn)雙倒數(shù)方程對(duì)數(shù)據(jù)的處理改進(jìn)的雙倒數(shù)方程形式與雙倒數(shù)方程相像，為其中是t這一段時(shí)間內(nèi)的平均速度；為反響過(guò)程中底物濃度的算術(shù)平均值。由于積分方程對(duì)任何反響程度的數(shù)據(jù)處理都是準(zhǔn)確的處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性如何，用可以通過(guò)與比照：從以上計(jì)算可以看出，用改進(jìn)的雙倒數(shù)方程作圖法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)，即使反響已進(jìn)展到30％，所引入的誤差也不過(guò)1％左右。很明顯，假設(shè)全部酶是飽和的，而且反響顯著不行逆，而且沒(méi)有產(chǎn)物抑制的狀況，用改進(jìn)雙倒數(shù)法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定Km和Vmax，可獲得準(zhǔn)確結(jié)果。如有必要，可用捕獲劑或偶聯(lián)酶使產(chǎn)物不斷移去，迫使反響不行逆，并使產(chǎn)物抑制成為最小。第四節(jié)酶的分析和檢測(cè)一、酶促反響初速度隨[Et]的變化酶促反響的初速度隨[Et]的變化而變化。通常在離體測(cè)定條件下，[Et]一般為10-12～10-7mol/L，而[St]為10-6～10-2mol/L?？蓪⒚资戏匠剔D(zhuǎn)變?yōu)橐韵滦问剑哼@樣，當(dāng)[S]為常數(shù)時(shí)，則初速度v與[Et]成正比。但一個(gè)酶促反響速度，常因[S]的轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變。因此反響時(shí)間必需盡可能短，使[S]幾乎處于恒態(tài)(即只有5％以下的底物形成產(chǎn)物)，才能得到真正的初速度，v與[Et]之間的關(guān)系才會(huì)是線性的。二、酶活力單位和比活力是指酶在肯定作用條件下，單位時(shí)間內(nèi)，使底物轉(zhuǎn)化的量或產(chǎn)物生成的量。也就是說(shuō)，酶量的多少是承受其催化力量來(lái)度量；換句話說(shuō)，是承受酶催化反響的速度來(lái)度量，由于在適當(dāng)?shù)臈l件下，v∝[E]。為了使酶單位的文獻(xiàn)報(bào)道能統(tǒng)一，并具有可比性，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議曾制訂了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物所需的酶量為一個(gè)酶單位。所謂特定條件，溫度定為25℃，pH、底物濃度等其它條件均定為最適條件。該酶單位稱為國(guó)際單位〔IU)。酶制劑中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶單位數(shù)，用U/mg蛋白表示。三、酶的轉(zhuǎn)換數(shù)轉(zhuǎn)換數(shù)可用兩種方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)來(lái)定義，即在最適條件下、每摩爾酶每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)(即每微摩爾酶的酶單位數(shù))。其二是很多酶為寡聚體。含幾個(gè)亞基，因此可用另一種方式來(lái)表示轉(zhuǎn)換數(shù)，即在最適條件下，每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘所轉(zhuǎn)變的底物摩爾數(shù)。這兩個(gè)值有時(shí)簡(jiǎn)潔以min-1表示，即：酶的kp值約在50～107min-1。碳酸酐酶是己知轉(zhuǎn)換數(shù)最高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即該酶一個(gè)催化周期為1.7微秒。第五節(jié)酶促反響的穩(wěn)態(tài)前動(dòng)力學(xué)一、快反響技術(shù)酶促反響動(dòng)力學(xué)爭(zhēng)論有兩條途徑：一是穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)。它是監(jiān)測(cè)整個(gè)反響，得到關(guān)于