發(fā)育生物學與再生醫(yī)學：Western blot

Westernblot背景印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法WesternBlot的基本原理

在電場的作用下，將電泳分離的蛋白質混合物從凝膠轉移至固相支持膜上，再利用某種蛋白（目的蛋白，如GAPDH）的特異性抗體來對其進行鑒定，可進行定量分析。WesternBlot的一般流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

轉膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色實驗目的及進度安排實驗目的：利用蛋白印記法檢測小鼠腦組織中GAPDH的表達進度安排：蛋白標準曲線的制定，蛋白樣品制備

SDS凝膠的制備，蛋白樣品SDS凝膠電泳，轉膜，封閉一抗雜交，二抗雜交，Western-ECL123456考馬斯亮藍溶液3ml3ml3ml3ml3ml3ml0.5mg/mlBSA020ul40ul60ul80ul100ulddH2O10080ul60ul40ul20ul0蛋白定量標準曲線原理：考馬斯亮藍G250與蛋白質分子結合形成復合物，在595nm處有最大光吸收，其值在一定范圍內（0-50ug）與蛋白濃度成正比。優(yōu)點：簡單易行；缺點：各種干擾因素較大打開分光光度計，預熱30min，將波長修改為595nm用干凈的比色皿，以1#管調零，作為參比溶液，以此測定2#—6#管，每管取均值測量結束后以ddH2O洗比色杯1次，95%乙醇洗3次，晾干待用依據測量結果繪制考馬斯亮藍曲線。蛋白樣品制備實驗原理：利用SDS等去垢劑破壞細胞的膜結構，細胞內含物（主要是蛋白質）釋放出來，常用RIPAbuffer等裂解液，在此裂解條件下DNA一般形成沉淀，蛋白質溶于上清中。注意事項：全部操作需在冰上進行；需要加蛋白酶抑制劑；實驗步驟：1、加入500ul的RIPAbuffer，用注射器反復吹吸，冰上孵育30分鐘；2、10,000g，4℃離心10分鐘，轉移上清（300ul）至新管；3、按照每管3ml考馬斯亮藍染液，2ul樣品，98ulddH2O配制液體；對照為：3ml考馬斯亮藍染液，2ulRIPA，98ulddH2O配制液體；4、用同樣方法在可見光分光光度計上測量OD595值；5、根據測量結果以及標準曲線計算出樣品中的蛋白含量；6、按總體積25ul，終濃度為1*RSB，還有25ug蛋白混合樣品，不足體積用1*PBS補足7、短暫離心，煮沸5min，短暫離心，上樣電泳。SDS（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳）

蛋白質電泳的行為：帶電性和分子量

原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當SDS與蛋白質混合時,它會以其碳鏈與蛋白質之疏水性胺基酸結合將蛋白質包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用，由于SDS帶強負價,使蛋白質原先的帶電價微不足道,所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素。濃縮膠（4%）PH6.8分離膠（5-15%）

PH8.8分離膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212PH8.3分離膠：1.5MTris-HClpH8.8濃縮膠：0.5MThis-HCLpH6.8膠濃度ddH2O

凝膠儲備液（ml）Gelbuffer(ml)10%V/VSDS(ml)10%APS(ul)TEMED(ul)4%(濃縮膠)6.11.32.50.1502010%（分離膠）4.13.32.50.15010濕法：將凝膠和固相基質象夾在濾紙中間，浸泡在轉移裝置的緩沖液中，電轉45min或過夜，需冰盒散熱。步驟較為繁瑣。蛋白質分子量較大（100KD）建議用濕轉。轉膜半干法：將凝膠和固相基質象三明治一樣加在用緩沖液浸潤的濾紙之間。與濕轉相比，半干法又快（15-45分鐘）又方便?？梢酝瑫r高效轉移大小不同的蛋白。小分子量的蛋白半干轉效果比較好。轉膜步驟1、將電泳后的膠取出浸入TransferBuffer，搖床緩慢搖30分鐘。戴手套裁取PVDF膜，甲醇浸透，倒掉甲醇，浸入蒸餾水或1*PBS中；2、將PVDF膜浸入TransferBuffer至少10分鐘；3、用TransferBuffer潤濕的墊墊鋪于夾子的負極面上（黑色），將二張Whatman3mm濾紙鋪于墊墊上，將凝膠貼于濾紙上，將PVDF膜鋪于凝膠上,注意不要留氣泡；4、再將二張Whatman3mm濾紙鋪于PVDF上，最后將墊墊鋪于濾紙上，用玻璃試管趕去氣泡；5、將夾子放入轉印槽中，蓋上頂層電極板，接通正負極電源，100V轉移50分鐘。封閉（非特異抗原表位）封閉液：5%脫脂奶粉；封閉時間：室溫1h抗體雜交一抗：山羊抗小鼠二抗：兔抗山羊倒掉封閉液，洗膜液略洗一下，加入一抗（1:3000，共3ml），搖床上室溫雜交1h；取出PVDF膜，洗膜液洗3次，每次5min；倒掉洗膜液，加入二抗（1:8000），搖床上室溫雜交30min取出PVDF膜，洗膜液洗3次，每次5min；抗體選擇的原則一抗可以與要檢測的蛋白特異結合，二抗可與一抗結合，同時二抗上帶有特異的酶（如堿性磷酸酶法AP,化學發(fā)光顯色法HRP),此酶可以分解底物使膠片感光。一二抗均使用封閉液（PBST+5%BSA或脫脂奶）來稀釋，按照抗體說明書所說的稀釋比例及預實驗去調整最佳的稀釋比例ECL發(fā)光1、倒掉洗膜液，將PVDF膜夾于吸水紙中間，吸去多余液體，轉膜時與膠相鄰的一面向上，鋪于玻璃板上；2、將ECL試劑盒內的detectionreagent1與detectionreagent2等體積混合后，均勻滴在PVDF膜上，反應1分鐘3