DB1509T 0001-2023奶綿羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30CCSB441509IDB1509/T0001—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由烏蘭察布市農(nóng)牧局提提出。本文件由烏蘭察布市農(nóng)牧局提歸口。本文件起草單位：烏蘭察布市畜牧工作站、內(nèi)蒙古大學(xué)、蒙天然牧業(yè)科技發(fā)展有限公司、烏蘭察布市市場監(jiān)督管理局、內(nèi)蒙古豐東知盈牧業(yè)科技有限公司、察右中旗市場監(jiān)督管理局。本文件主要起草人：張立果、張立、王申元、蘇小虎、魏潤元、李光鵬、寇慧娟、朱怡靜、鄭重、劉建寧、于濤、劉權(quán)、蘇廣華、楊磊、薩仁格勒、楊柳、閆鑫鵬、侯仕農(nóng)、王景龍、郝佳惠、劉信、賈俊欣、米布農(nóng)、鄭少華、張莉、竇英杰、趙躍芳。1DB1509/T0001—2023奶綿羊冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了奶綿羊冷凍精液生產(chǎn)的基本要求、精液處理、精液冷凍、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸、貯存。本文件適用于奶綿羊冷凍精液生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定GB/T5458液氮生物容器GB20557山羊冷凍精液3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1奶綿羊dairysheep以產(chǎn)奶為主的綿羊。3.2精子活力spermmotility在顯微鏡恒溫載物臺38℃環(huán)境下直線前進(jìn)運(yùn)動精子占總精子數(shù)的百分率。3.3精子畸形率abnormalspermpercentage畸形精子占總精子數(shù)的百分率。3.4細(xì)菌數(shù)bacteriacount每劑量精液經(jīng)培養(yǎng)后觀察到的細(xì)菌菌落數(shù)。3.5頂體完整性acrosomeintegrity頂體完整的精子占總精子數(shù)的百分率。3.6質(zhì)膜完整性plasmamembraneintegrity質(zhì)膜完整的精子占總精子數(shù)的百分率。3.7冷凍精液frozensemen經(jīng)特殊方法處理超低溫冷凍后在液氮中（-196℃)保存的精液。2DB1509/T0001—20234精液采集4.1種公羊選擇具有種用價值、系譜完整、體質(zhì)健康、無遺傳病，不應(yīng)有已發(fā)布的動物防疫法中所明確的二級疫病中的任何一種疾病。4.2采集精液4.2.1臺羊選擇性格溫順、四肢健康的發(fā)情母羊作為臺羊，將臺羊后驅(qū)清理干凈。4.2.2種公羊處理采精前剪短包皮周圍長毛，清洗消毒包皮。4.2.3采精器假陰道、集精杯提前滅菌消毒。安裝采精器，保證采精器結(jié)實(shí)不漏水。采精時在采精器分層中注入適量40℃~45℃的水。吹氣使其外口呈三角形，假陰道上端均勻涂抹凡士林。4.2.4精液采集采精時，工作人員半蹲于臺羊的左側(cè)后方，右手握住假陰道，并與地面成約45°。當(dāng)公羊穩(wěn)定爬胯時，利用假陰道迅速采集精液并將其置于38℃水浴鍋中，記錄采精量。4.3新鮮精液評估采集精液符合以下評估標(biāo)準(zhǔn)方可進(jìn)行稀釋、冷凍：a)色澤呈乳白色或淺黃色，肉眼可見云霧狀運(yùn)動；b)精子活力≥65%；c)精子密度≥2×109個/mL；d)精子畸形率≤15%。5稀釋液配制5.1儀器燒杯、量筒、磁力攪拌器、天平。5.2化學(xué)試劑所有化學(xué)試劑（化學(xué)純以上）：Tris、檸檬酸、果糖、M199、大豆卵磷脂、青霉素、鏈霉素、甘油、超純水。5.3稀釋液配方A液：Tris2.71g、檸檬酸1.4g、果糖1g、M1992mL、大豆卵磷脂1g、青霉素10000IU、鏈霉素10g，加超純水至100mL。B液：取A液90mL，甘油10mL。3DB1509/T0001—20236精液稀釋6.1稀釋密度稀釋密度大于等于1.2×108個/mL。6.2精液稀釋6.2.1將稀釋液在38℃水浴鍋中預(yù)熱30min，通過測定鮮精密度和采精量，計算出稀釋后總體積；6.2.2選用合適容積的器皿用A液先對其進(jìn)行1：1（鮮精：A液）稀釋；靜置10min后1：4稀釋（鮮精：A液）；靜置10min后1：8（鮮精：A液）稀釋，靜置10min；6.2.3加A液至總體積的一半；6.2.4將稀釋后的精液封口并放于含有38℃水的燒杯中，6.2.5將其放置4℃冰箱中平衡2h后加稀釋液B液至總體積，置于4℃冰箱中平衡1h。6.3細(xì)管精液的分裝、標(biāo)識用無菌0.25mL細(xì)管分裝，兩端封口應(yīng)嚴(yán)密，管內(nèi)無氣泡。細(xì)管橫向標(biāo)識順序從左到右依次為：羊號、生產(chǎn)日期。7精液冷凍7.1冷凍設(shè)備制作凍精的設(shè)備為適用0.25mL細(xì)管的程控冷凍儀。7.2冷凍程序及操作步驟7.2.1按照程控冷凍儀的操作步驟對精液進(jìn)行冷凍。冷凍程序?yàn)椋?℃~-10℃（降溫速率5℃/min-10℃~-100℃（降溫速率60℃/min-100℃~-140℃（降溫速率20℃/min）。7.2.2精液冷凍前30min，將液氮閥和排氣閥打開以平衡液氮罐和冷凍箱內(nèi)的壓力，待冷凍箱內(nèi)溫度7.2.3打開冷凍箱蓋，將放有細(xì)管精液的托架放入冷凍箱內(nèi)，關(guān)閉冷凍箱蓋進(jìn)行精液冷凍；7.2.4當(dāng)溫度下降至-140℃時冷凍結(jié)束，保持30s后取出分裝。7.3凍精包裝和貯存細(xì)管置入液氮并分裝凍存，同時留樣檢測凍精質(zhì)量。細(xì)管凍精用專用的塑料管包裝，每管25支，再將塑料管裝入紗布袋，紗布袋系緊口，確保細(xì)管不掉。貯存凍精的低溫容器應(yīng)符合GB/T5458的要求；及時補(bǔ)充液氮，每年補(bǔ)充液氮；取放凍精時，凍精離開液氮不應(yīng)超過10s。8精液解凍水浴鍋38℃~40℃預(yù)熱30min以上，待水浴鍋溫度穩(wěn)定后，迅速從貯存罐中取出預(yù)留凍精，在空氣中放置15s～20s，然后放入38℃~40℃水浴鍋中15s～20s并輕輕搖晃；取出細(xì)管用無菌吸水紙擦拭干凈。4DB1509/T0001—20239凍精質(zhì)量檢測9.1細(xì)管外觀細(xì)管無裂痕，兩端封口嚴(yán)密，標(biāo)識清晰。9.2凍精解凍后的要求9.2.1活力≥35%，應(yīng)符合GB20557的要求。9.2.2精子畸形率≤25%，應(yīng)符合GB20557的要求。9.2.3細(xì)菌數(shù)≤800個/0.25mL，檢測方法見GB4789.29.2.4頂體完整性≥45%，檢測方法見附錄A。9.2.5質(zhì)膜完整性≥35%，檢測方法見附錄B。5DB1509/T0001—2023（資料性）奶綿羊冷凍精液精子頂體完整性檢測方法A.1器材、試劑熒光顯微鏡、烘片機(jī)、多聚賴氨酸粘附性的載玻片、PBS、4%多聚甲醛、FITC-PSA、DAPI、甘油。A.2操作步驟A.2.1凍精準(zhǔn)備解凍3管冷精于1.5mL離心管中，加入1mL洗精液并混勻；1500rpm離心5min，棄上清，留約20A.2.2固定加入適量的PBS重懸精子沉淀，并向其中加入4%多聚甲醛對精子進(jìn)行固定，固定約30min。A.2.3洗滌向精液中加入PBS1mL，1500rpm離心5min洗滌2次以除去精漿，多聚甲醛等，洗滌后加入1mLPBS重懸精子沉淀。A.2.4涂片染色取10μL精液均勻涂于多聚賴氨酸粘附性的載玻片上，并將其放于烘片機(jī)上干燥；加10μLFITC-PSA對精子進(jìn)行避光染色15min；用超純水緩慢洗滌玻片并干燥；加5μLDAPI染色液避光染色5min。A.2.5洗滌干燥用超純水緩慢洗滌玻片，放烘片機(jī)上干燥，并用PBS與甘油的混合物封片。A.2.6鏡檢熒光顯微鏡下觀察，共計數(shù)至少200個精子來統(tǒng)計凍后精子頂體完整性，若精子頭部均染成明亮的綠色熒光且均勻即頂體完整（AI）；已發(fā)生頂體反應(yīng)（AR）的精子僅在赤道帶出現(xiàn)熒光染色，或者頭部無綠色熒光。A.2.7計算所檢凍精的頂體完整率按照公式A.1計算：C=C1/S×100%................................（A.1）式中：C——頂體完整率，%；C1——頂體完整，單位為個；S——總精子數(shù)，單位為個。6DB1509/T0001—2023（資料性）奶綿羊冷凍精液質(zhì)膜完整性檢測方法B.1器材、試劑熒光顯微鏡、恒溫水浴鍋、洗精液、低滲溶液、PBS。B.2操作步驟B.2.1凍精準(zhǔn)備B.2.2低滲溶液處理吸取200μL精液加到1mL低滲溶液中。放