蛋白質結構新

第二章蛋白質結構1蛋白質概述2氨基酸3蛋白質結構與功能4蛋白質分析法1蛋白質概述1、開展歷史2、生物學功能3、概念4、組成及N含量的測定2蛋白質概述-開展歷史費歇爾〔EmilFischer〕確定了分子的氨基酸的根本骨架。1902年他提出了蛋白質的多肽結構學說。指出：蛋白質分子是許多氨基酸以肽鍵結合而成的長鏈高分子化合物。隨后他合成了100多種多肽化合物，1907年，他制取了由18種氨基酸分子組成的多肽。由于積勞成疾，身體狀況惡化，也由于第一次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，費歇爾不得不中斷了這一重要的研究。3蛋白質概述-開展歷史英國生物化學家弗雷德·桑格爾〔Fred(Frederick)Sanger，1918年8月13日—2021年11月19日〕。分別獲得1958年和1980年諾貝爾化學獎。他是同一領域內兩次獲獎的第二人，測序。1958：弗雷德·桑格爾創(chuàng)造酶法測定人胰島素序列，從而確定胰島素的分子結構，開創(chuàng)了蛋白質測序的領域。1980：弗雷德·桑格爾、沃爾特·吉爾伯特共同榮獲諾貝爾化學獎。他們的奉獻在于：分別使用不同的方法測定DNA的序列。Sanger法后來成為主流，并用于人類基因組方案〔HGP〕的測序。41951年，鮑林發(fā)現了蛋白質的根本結構〔二級結構〕〔1954年和1962年獲諾貝爾獎〕。蛋白質概述-開展歷史萊納斯·卡爾·鮑林〔LinusCarlPauling，1901年2月28日－1994年8月19日〕，美國著名化學家，量子化學和結構生物學的先驅者之一。1954年因在化學鍵方面的工作取得諾貝爾化學獎。1962年因反對核彈在地面測試的行動獲得諾貝爾和平獎。他所撰寫的?化學鍵的本質?被認為是化學史上最重要的著作之一。51960年佩魯茨和肯德魯對血紅蛋白和肌紅蛋白進行結構分析，解決了三維空間結構，獲1962年化學獎。

50年代后期，豪普特曼和卡爾勒建立了應用X射線分析的以直接法測定晶體結構的純數學理論，在晶體研究中具有劃時代的意義，特別在研究生物大分子如激素、抗生素、蛋白質及新型藥物分子結構方面起了重要作用。他們因此獲1985年化學獎。

蛋白質概述-開展歷史6蛋白質的生物學功能1〕作為生物催化劑enzyme2〕代謝調節(jié)功能hormone3〕免疫保護功能Ab4〕物質的轉運和儲存功能binding-component5〕運動與支持6〕參與細胞間信息傳遞蛋白質概述-生物學功能7蛋白質概述-概念什么是蛋白質？蛋白質(protein)是由許多氨基酸〔aminoacid)通過肽鍵相連形成的高分子含氮化合物。蛋白質的生物學重要性蛋白質是構成生物體的根本成分，占人體干重45%，細胞70%。8組成蛋白質的元素主要元素：碳〔50%—55%〕、氫〔6%—8%〕、氧〔19%—24%〕、氮〔13%—19%〕；次要元素：硫、磷、鐵、錳、鋅、碘。蛋白質元素組成的特點：各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16%那么可通過測N→測Pr。即每克樣品蛋白質的含量=每克樣品的含氮量×6.25測氮的方法：凱氏定氮法蛋白質概述-組成91、凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。

在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽；

堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收；

以標準堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。蛋白質概述-N含量測定10蛋白質概述-N含量測定2、雙縮脲法：雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。雙縮脲法常用于0.5g/L-10g/L含量的蛋白質溶液測定。11蛋白質概述-N含量測定3、考馬斯亮藍(CoomassieBrilliantBlue)法考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。12氨基酸1、氨基酸的通式2、氨基酸的分類3、氨基酸的特點4、氨基酸的理化性質13氨基酸〔aminoacid〕：含有一個堿性氨基和一個酸性羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質的根本組成單位。氨基連在α-碳上的為α-氨基酸。天然氨基酸均為α-氨基酸。氨基酸1、氨基酸〔AA〕的通式α-氨基和α-羧基142、氨基酸的分類〔根據氨基酸分子的化學結構〕〔1〕脂肪族氨基酸：甘、丙、纈、亮、異亮、蛋、天冬、谷、賴、精、絲、蘇、半胱、天冬酰胺、谷氨酰胺〔2〕芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸〔3〕雜環(huán)族氨基酸：組氨酸〔4〕雜環(huán)亞氨基酸：脯氨酸氨基酸152、氨基酸的分類〔根據側鏈基團的結構和性質不同〕非極性氨基酸〔疏水氨基酸〕8種丙氨酸〔Ala〕纈氨酸〔Val〕亮氨酸〔Leu〕異亮氨酸〔Ile〕脯氨酸〔Pro〕苯丙氨酸〔Phe〕色氨酸〔Trp〕蛋氨酸〔Met〕

極性氨基酸〔親水氨基酸〕：氨基酸的極性取決于側鏈基團，如果側鏈是不對稱的極性基團，這個氨基酸就是極性氨基酸。極性氨基酸包括：帶電荷的五種，再加上Gly,Ser,Thr,Cys,Asn,Gln,Tyr。氨基酸161〕極性不帶電荷：7種甘氨酸〔Gly〕絲氨酸〔Ser〕蘇氨酸〔Thr〕半胱氨酸〔Cys〕酪氨酸〔Tyr〕天冬酰胺〔Asn〕谷氨酰胺〔Gln〕2〕極性帶正電荷的氨基酸〔堿性氨基酸〕3種賴氨酸〔Lys〕精氨酸〔Arg〕組氨酸〔His〕3〕極性帶負電荷的氨基酸〔酸性氨基酸〕2種〔or4?〕天冬氨酸〔Asp〕谷氨酸〔Glu〕氨基酸17氨基酸18氨基酸193、氨基酸的特點：〔1〕20種根本氨基酸中，除脯氨酸為亞氨基酸外，其余19種均符合通式；〔2〕除甘氨酸的R基為H外，其余19種α-碳原子為不對稱碳原子，有L、D型之分，但組成人體蛋白質的氨基酸均為L型。按Fischer投影式：羧基在上方，氨基在左側的是L型，在右側的是D型?！?〕不同氨基酸的側鏈基團不同。氨基酸20氨基酸4氨基酸的理化性質無色晶體，熔點一般在200℃以上。不同的氨基酸其味不同，有的無味，有的味甜，有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。各種氨基酸在水中的溶解度差異很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出?！?〕熔點和溶解度21氨基酸〔2〕兩性解離及等電點等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。22氨基酸+OH-+H++OH-+H+pH<pI陽離子pH=pI氨基酸的兼性離子

pH>pI陰離子23氨基酸小題：在生理pH下以下哪一種氨基酸帶正電荷？A天冬氨酸B色氨酸C谷氨酸D半胱氨酸E賴氨酸24氨基酸〔3〕紫外吸收氨基酸的一個重要光學性質是對光有吸收作用。20種蛋白質氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收，在遠紫外區(qū)〔<220nm〕均有光吸收，在紫外區(qū)〔近紫外區(qū)〕〔220nm—300nm〕只有三種氨基酸有光吸收能力，這三種氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)。25氨基酸原理：它們的R基含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。苯丙氨酸最大光吸收在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白質一般都含有這三種AA殘基，所以其最大光吸收在大約280nm波長處，因此能利用分光光度法很方便的測定蛋白質的含量。分光光度法測定蛋白質含量的依據是朗伯—比爾定律，在280nm處蛋白質溶液吸光值與其濃度成正比。

26蛋白質結構與功能〔一〕肽(peptide)(二〕蛋白質的分子結構〔三〕結構與功能27蛋白質結構與功能〔一〕肽(peptide)*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的

-羧基與另一個氨基酸的

-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。28+蛋白質結構與功能-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵29蛋白質結構與功能肽鍵由于共振而具有局部雙鍵性質，因此，肽鍵比一般C-N鍵短，且不能自由旋轉肽鍵原子及相鄰的a碳原子組成肽平面相鄰的a碳原子呈反式構型30蛋白質結構與功能肽鍵比一般C-N鍵短肽鍵為一平面相鄰的a碳原子呈反式構型31蛋白質結構與功能*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合那么形成三肽……*由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。概念32多肽鏈的兩端蛋白質結構與功能N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端33蛋白質結構與功能(二）蛋白質的分子結構一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構34蛋白質結構與功能一級結構：定義蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。35蛋白質結構與功能一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的根底。36二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。主要的化學鍵：氫鍵多肽可以折疊成幾種規(guī)那么結構。

蛋白質結構與功能37蛋白質結構與功能

蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉角(

-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil)

38蛋白質結構與功能

-螺旋右手α-螺旋每圈有3.6個氨基酸，在肽鏈的N-H與相隔三個殘基的C=O基團間形成氫鍵以穩(wěn)定其整體結構。

α-螺旋的穩(wěn)定性很好，除甘氨酸及脯氨酸外的其他各種氨基酸通過肽鍵構成主鏈時都有形成α-螺旋的傾向。

39蛋白質結構與功能Thebeta-sheet

-折疊常見的蛋白質二級結構之一，它呈片狀，肽鏈幾乎完全伸展的，而非緊密卷曲平行式。平行式：所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同。在蛋白分子內部更多出現的是平行的β-折疊片；而反平行的β-折疊片一段暴露于溶劑中，一段埋于蛋白內部，其氨基酸序列常為親水和疏水的氨基酸交替排列。

40蛋白質結構與功能β－轉角肽鏈走向的屢次逆轉，主要是通過β-轉角來實現的，可使肽鏈出現180°回折。β-轉角大多分布在球狀蛋白質分子外表，以改變肽鏈。它是一個發(fā)夾式轉折，其特點是在于多肽鏈中第n個殘基的-CO基與第n+3個殘基的-NH基形成氫鍵。因此，一個多肽鏈的走向可以得到很好的扭轉。β-轉角在球狀蛋白質中是重要的二級結構，起到連接其他二級結構的作用。41蛋白質結構與功能無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性但擁有緊密有序的穩(wěn)定結構的肽鏈構象，主鏈間可形成氫鍵，主鏈與側鏈之間也可以形成氫鍵。這些氫鍵共同維持了它結構上的穩(wěn)定。無規(guī)卷曲大體上分為兩種，即緊密環(huán)和連接條帶。a、緊密環(huán)〔compactloop〕：肽鏈片段的主體結構形成一段開放的環(huán)狀，其主鏈卷曲成希臘字母Ω故又稱Ω環(huán)。b、連接條帶：α-α連接；α-β和β-α連接；42蛋白質結構與功能鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體

鋅指結構

在許多蛋白質分子中，可發(fā)現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)或基序。模體43蛋白質結構與功能氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響蛋白質二級結構是以一級結構為根底的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。相對應的結構預測軟件44蛋白質結構與功能三級結構：不同的二級結構區(qū)域和連接區(qū)的組合折疊成一個確定的三級結構，結果是絕大多數親水性氨基酸在外外表，而疏水性氨基酸在內部，其結構經非共價相互作用，有時是二硫鍵來穩(wěn)定。變性往往導致二級和三級結構的喪失。整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。主要的化學鍵疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等45蛋白質結構與功能46結構域蛋白質結構與功能大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。47

結構域、基序、家族與進化：結構域可在一條肽鏈中形成半獨立的結構和功能單位。結構域常由一個基因中的單個外顯子編碼。新的蛋白質可能是從外顯子的新組合即由此產生的蛋白質的結構域的重新組合進化而來。

基序(motif)是二級結構元件組合或在蛋白質家族的相關成員中常發(fā)現的氨基酸序列。

蛋白質家族通過基因復制和隨后的基因趨異進化產生。蛋白質結構與功能48蛋白質結構與功能四級結構有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基(subunit)。蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。49分子伴侶蛋白質結構與功能分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水局部結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。50蛋白質結構與功能從一級結構到四級結構51蛋白質結構與功能〔三〕結構與功能蛋白質復雜的組成和結構是其多種多樣生物學功能的根底；而蛋白質獨特的性質和功能那么是其結構的反映。蛋白質一級結構包含了其分子的所有信息，并決定其高級結構，高級結構和其功能密切相關。1、蛋白質一級結構與功能2、蛋白質高級構象與功能52一級結構與功能的關系蛋白質結構與功能例：鐮刀形紅細胞貧血正常N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu···C(146)非正常N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu···C(146)53蛋白質結構與功能蛋白質空間結構與功能的關系Hb〔血紅蛋白〕與Mb〔肌紅蛋白〕一樣能可逆地與O2結合。Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數〔稱百分飽和度〕隨O2濃度變化而改變。54血紅蛋白運氧中有別構作用：當血紅蛋白分子第一個亞基與氧結合后，該亞基構象的輕微改變，可導致4個亞基間鹽鍵的斷裂，使亞基間的空間排布和四級結構發(fā)生輕微改變，血紅蛋白分子從較緊密的T型轉變成較松弛的R型構象，從而使血紅蛋白其他亞基與氧的結合容易化，產生了正協(xié)同作用。蛋白質結構與功能55蛋白質結構與功能協(xié)同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協(xié)同效應。如果是促進作用那么稱為正協(xié)同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用那么稱為負協(xié)同效應(negativecooperativity)56蛋白質結構與功能變構效應(allostericeffect)蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象疾病：假設蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。57蛋白質的分析法蛋白質別離純化蛋白質濃縮、枯燥和保存蛋白質分析和研究技術蛋白質測序和功能分析等58蛋白質別離純化的意義1〕從生物材料中別離制備蛋白質、核酸，研究其結構與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，說明生命現象的本質有重大意義。2〕工業(yè)生產需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。3〕醫(yī)療需要：胰島素治療糖尿病。蛋白質的分析法-別離純化59別離純化的要求1〕純度：取決于研究的目的和應用上的要求。研究一級結構、空間結構與功能的關系的蛋白質制劑；工具酶和標準蛋白等都要求均一；工業(yè)應用的酶和蛋白質制劑到達一定純度即可。2〕活性：要求大分子保持天然構象狀態(tài)，有高度的生物活性。3〕收率：希望收率越高越好，但在別離純化過程中總會有損失，而且提純步驟越多，損失越大。蛋白質的分析法-別離純化60別離純化的一般程序生物大分子的別離純化一般可分為以下幾個階段：①材料的選擇和預處理②破碎細胞及提取〔有時還需要進行細胞器的別離〕③別離純化：包括粗分級別離和細分級別離

前兩個階段為生物大分子別離純化的前處理。蛋白質的分析法-別離純化61蛋白質的分析法-別離純化1、別離純化前處理2、蛋白質別離純化條件〔溶液環(huán)境〕3、蛋白質混合物別離方法62蛋白質的分析法-別離純化前處理細胞的破碎別離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當的方法將組織和細胞破碎。假設材料是體液或生物體分泌到體外的分泌物，那么不必進行組織細胞的破碎。631〕機械法通過機械切力作用使組織細胞破碎的方法，如勻漿、研磨、搗碎。高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約三分之一體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。適用于動物內臟組織、植物肉質種子等。玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎。此方法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少的動物臟器組織。蛋白質的分析法-別離純化前處理細胞破碎方法：64蛋白質的分析法-別離純化前處理玻璃勻漿器652〕物理法通過各種物理因素作用使組織細胞破碎，如超聲法、反復凍融法、冷熱交替法、低滲裂解法。超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。該方法多適用于微生物材料，例如用大腸桿菌制備各種酶。該方法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感的樣品和核酸應慎用。反復凍融法：將細胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。蛋白質的分析法-別離純化前處理66蛋白質的分析法-別離純化前處理超聲波細胞破碎儀673〕化學法有機溶劑法：〔丙酮〕；外表活性劑：SDS,Triton-100；酶解法：溶菌酶，蛋白酶等〔較溫和〕。蛋白質的分析法-別離純化前處理68細胞器的別離細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內質網，植物細胞還有葉綠體。細胞器的別離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當的介質中進行離心，常用的介質有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質量大小的不同，經過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經屢次分步離心后，即可獲得所需組分。蛋白質的分析法-別離純化前處理69蛋白質的分析法-蛋白質別離純化條件1〕緩沖液緩沖液對維持一定pH值下蛋白質的穩(wěn)定及重復性十分重要。一般pH在7.0-7.5之間。2〕鹽、金屬離子和鰲合劑大多數蛋白在稀鹽溶液中才能溶解，因此采用含鹽的緩沖液，通常用0.1-0.2M的NaCl或KCl來模擬生理狀態(tài)下的離子強度。為減少金屬離子對蛋白質的影響，可以在緩沖液中參加特異的金屬離子鰲合劑。蛋白質別離純化條件〔溶液環(huán)境〕703〕復原劑細胞在破碎狀態(tài)，一些蛋白會被氧化而失去活性，可參加復原劑如抗壞血酸巰基乙醇，二硫蘇糖醇等。4〕去污劑作用是破細胞膜，釋放細胞內蛋白(1)離子型去污劑SDS對蛋白質有變性作用(2)非離子型去污劑TritonX-100,NP-40變性作用較弱。5)蛋白酶抑制劑抑制蛋白酶的活性，減少對蛋白質的降解。常用的蛋白抑制劑有PMSF,Pepstatin,Leupeptin等。蛋白質的分析法-蛋白質別離純化條件71蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法1、利用溶解度差異的別離方法〔1〕鹽析法用于粗別離,原理是中性鹽溶液破壞蛋白質親水基團與水形成的水化膜程度和改變蛋白質帶電情況。〔2〕有機溶劑提取法一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的提脂蛋白的提取液?！?〕等電點法利用蛋白質在等電點的溶解度最低，而各種蛋白質具有不同的等電點的特點進行別離的方法。72蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法2、根據分子量不同的別離方法〔1〕透析和超濾透析法是利用蛋白質不能透過半透膜的性質，使蛋白質和其它小分子物質如無機鹽、單糖等分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。73蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法〔2〕平衡離心法根據蛋白質大小、形狀不同進行別離的技術。〔3〕凝膠過濾層析也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小別離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠〔Sephadexged〕和瓊脂糖凝膠〔Agarosegel〕。74〔4〕聚丙烯酰胺凝膠電泳〔PAGE〕

(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE〕蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法凝膠電泳分類：75原理:SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。強復原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中參加復原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈和SDS結合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法76蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法2.裝置

垂直板狀 圓盤狀 水平板77蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法78蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法染料種類:79考馬斯亮藍染色銀染色蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法凝膠染色結果：80蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法3、根據電荷不同的別離方法離子交換層析(IonExchangechromatography,IEC)離子交換劑有陽離子交換劑〔如：羧甲基纖維素；CM-纖維素〕和陰離子交換劑。當被別離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度方法將吸附的蛋白質洗脫下來。81蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法4、特異性別離親和層析〔affinitychromatography〕許多生物大分子具有與其結構相對應的專一分子發(fā)生可逆性結合的特性，分子間的這種結合能力稱為親和力。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand〕的分子能特異而非共價地結合。親和層析法是別離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中別離出來，而且純度很高。82蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法親和層析示意圖83蛋白質的純化無固定的模式，不同的蛋白質有不同的純化方法，同一種蛋白質也可采取不同的純化方法，但最終得到的蛋白質其穩(wěn)定性和純度也有所差異，這就涉及到操作者的實踐經驗及對純化藝術的理解。蛋白質的分析法-蛋白質混合物別離方法小結：84蛋白質的分析法-蛋白質的濃縮、枯燥和保存1〕樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮?！?〕減壓加溫蒸發(fā)濃縮〔2〕空氣流動蒸發(fā)濃縮〔3〕冰凍法生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中〔4〕吸收法通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。〔5〕超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下〔氮氣壓或真空泵壓〕通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保存，這是近年來開展起來的新方法。85蛋白質的分析法-蛋白質的濃縮、枯燥和保存2〕枯燥生物大分子制備得到產品，為防止變質，易于保存，常需要枯燥處理，最常用的方法是冷凍枯燥和真空枯燥。冷凍枯燥：將含水物料冷凍到冰點以下，使水轉變?yōu)楸?，然后在較高真空下將冰轉變?yōu)檎魵舛サ目菰锓椒?。真空枯燥：是一種將物料置于真空負壓條件下，使水的沸點降低，在真空負壓條件下可使水的沸點降到20℃甚至零度以下開始蒸發(fā)。86蛋白質的分析法-蛋白質的濃縮、枯燥和保存3〕貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關系?？菰锏闹破芬话惚容^穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將枯燥的樣品置于枯燥器內〔內裝有枯燥劑〕密封，保持0－4度冰箱即可。液態(tài)貯藏時應注意以下幾點。〔1〕樣品不能太稀，樣品太稀易使生物大分子變性?！?〕一般需參加防腐劑和穩(wěn)定劑?！?〕貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的那么要求更低，應視不同物質而定。87蛋白質的分析法-蛋白質分析和研究技術1、Western-Blotting(Immunoblotting免疫印跡〕蛋白質印跡法(免疫印跡),根本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息?？梢詫旌衔镏幸环N或多種特異蛋白進行定性和半定量檢測。88蛋白質的分析法-蛋白質分析和研究技術Western-blot過程示意圖89蛋白質的分析法-蛋白質分析和研究技術WesternBlotting的操作步驟〔1〕、SamplePreparation〔2〕、GelelectrophoresisStackinggel(5%)PH=6.8Separationgel(>5%)PH=8.890Electrophoretictransfer

nitrocelluloseorpolyvinylidenefluoride(PVDF)membrane蛋白質的分析法-蛋白質分析和研究技術〔3〕蛋白質的電轉移〔Nitrocellulosetransfer〕91Preventnon-specificproteininteractionsbet