基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的軟海綿酸檢測(cè)方法的建立

基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法的軟海綿酸檢測(cè)方法的建立

大田軟海綿酸（oa）是腹瀉性貝類(lèi)毒素（sd）的主要成分。這種海藻來(lái)源廣泛。它是中國(guó)最常見(jiàn)的中毒事件之一，也是最大的破壞因素之一。然而，中國(guó)尚未應(yīng)用于可接近的軟海綿酸檢測(cè)方法。因此，有必要對(duì)中國(guó)自己的軟海綿酸檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn)。與其他檢測(cè)方法相比,酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性高和檢測(cè)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn),在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)上具有開(kāi)發(fā)前景,近年來(lái)在赤潮藻毒素快速檢測(cè)方面得到重視和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室在成功制備高效價(jià)OA單克隆抗體的基礎(chǔ)上,初步建立了檢測(cè)OA的間接競(jìng)爭(zhēng)酶免疫學(xué)檢測(cè)方法,為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的相關(guān)檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料和試劑雜交瘤細(xì)胞株由本課題組研制和凍存;BALB/c健康小鼠由中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心研究所提供。其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。1.2單克隆抗體制備按常規(guī)小鼠腹水法制備單克隆抗體。1.3抗原劑2.5mg/l的制備按文獻(xiàn)的方法制備。1.4間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法的建立1.4.1抗羊血清學(xué)抗體檢測(cè)在96孔ELISA板上按常規(guī)方法進(jìn)行。檢測(cè)抗原用包被緩沖液pH9.6,0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000四個(gè)濃度,每濃度做3個(gè)重復(fù);OA抗體用含5%牛血清的稀釋液稀釋成1∶5000、1∶10000∶1∶15000、1∶20000、1∶40000、1∶6000、1∶8000七個(gè)濃度梯度;封閉液為1%明膠;酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG濃度為1∶5000;顯色液為T(mén)MB;終止液為2mol/LH2SO4。在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。1.4.2抗反應(yīng)時(shí)間根據(jù)以上試驗(yàn)選取最佳的抗原、抗體稀釋度包板,將一抗的保溫時(shí)間設(shè)為30、60、90、120min4組,每組3個(gè)平行,二抗反應(yīng)時(shí)間固定為60min。測(cè)定OD450值,選擇最佳一抗反應(yīng)時(shí)間。固定此最佳的一抗反應(yīng)時(shí)間,將二抗反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30、60、90、120min4組,每組3個(gè)平行,重復(fù)以上試驗(yàn),根據(jù)OD450值選擇最佳二抗反應(yīng)時(shí)間。1.4.3甲醇對(duì)免疫反應(yīng)的影響一抗和甲醇同時(shí)加入,每孔甲醇終濃度設(shè)置為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等11個(gè)濃度梯度,測(cè)OD450值。根據(jù)OD450值的大小進(jìn)行判定甲醇對(duì)免疫反應(yīng)的影響。甲醇溶解OA后和一抗同時(shí)加入,OA濃度為1∶8000;每孔甲醇的終濃度為20%、30%、40%。另設(shè)一組不加OA的作為陰性對(duì)照組。測(cè)OD450值,計(jì)算出抑制率。1.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制OA終濃度稀釋為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL13個(gè)濃度梯度,按最佳的稀釋度和反應(yīng)時(shí)間,用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)OD450值,以抑制率(P/N)為縱坐標(biāo),以log(10×OA濃度)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。1.6elisa法提取殘余物方法參見(jiàn)(Tagmouti-TalhaF,2000)。將貝類(lèi)樣品洗凈、勻漿,稱(chēng)取5g于離心管,加入弱酸性的甲醇溶液,隨后加入一定量的OA標(biāo)準(zhǔn)液。3500r/min離心10min,取上清。將上清分裝兩管,分別加入甲醇和正己烷,渦旋混勻,靜止分層。棄正己烷層,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干,加少量甲醇溶解壁上附著物,再蒸干。最后用100μL甲醇溶解殘余物,再加900μLPBST,混勻。提取物進(jìn)行ELISA檢測(cè)。OA的實(shí)測(cè)含量(ng/mL)是根據(jù)酶標(biāo)板上測(cè)得OD450值后由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得log(10×OA濃度),再通過(guò)反對(duì)數(shù)計(jì)算得出。1.7準(zhǔn)確度測(cè)量取一定量樣品,平行提取,同時(shí)檢測(cè),求得實(shí)測(cè)濃度。1.8加標(biāo)回收率a抑制率P/N(%)=(A0-A)/A0×100%(A為吸光值);回收率=實(shí)測(cè)濃度/添加濃度×100%;精密度=變異系數(shù)=SD/X(X為實(shí)測(cè)濃度的平均值,SD為標(biāo)準(zhǔn)差)。2結(jié)果2.1抗體最適工作濃度按試驗(yàn)方法測(cè)定OD450值,選OD450值為2.0左右的確定為抗原抗體最適工作濃度。結(jié)果顯示,檢測(cè)抗原OA-OVA按1:2000稀釋即濃度為1.25μg/L,單抗稀釋度為1:20000時(shí),既能保證免疫反應(yīng)效果好,又使得抗原抗體用量最少。2.2甲醇對(duì)aa免疫反應(yīng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明,未加OA時(shí),OD450隨著一抗中甲醇濃度的提高而遞增,當(dāng)甲醇終濃度高于10%時(shí),這種遞增趨勢(shì)更明顯。當(dāng)OA與甲醇同時(shí)加入時(shí),甲醇濃度的增加會(huì)降低OA免疫反應(yīng)的抑制率(如圖1)。因此,樣品提取時(shí),為了保證OA全部萃取出來(lái),可先用少量甲醇將其溶解,再用緩沖溶液PBST將甲醇含量稀釋到10%以下,而在ELISA檢測(cè)時(shí),可以直接用PBST稀釋OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液,將甲醇對(duì)檢測(cè)的干擾減少到最低值。2.3抗a間接競(jìng)爭(zhēng)免疫抑制反應(yīng)的穩(wěn)定性從試驗(yàn)結(jié)果得知,未加OA時(shí),吸光值OD450會(huì)隨著抗體反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,考慮到要節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,因而選用抗體反應(yīng)時(shí)間都為60min和90min進(jìn)行OA間接競(jìng)爭(zhēng)免疫抑制反應(yīng),結(jié)果如圖2所示,表明一抗和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為60min時(shí),其抑制率較高,即抗體對(duì)包被抗原結(jié)合反應(yīng)的抑制效果最好。2.4酶標(biāo)二抗溶液的配制用碳酸鹽緩沖液將OA-OVA包被原稀釋為1∶2000,包被96孔酶標(biāo)板,每孔100μL,4℃過(guò)夜;棄殘液,洗板;用1%明膠封板,每孔150μL,37℃下保溫2h;棄封閉液,洗板,用PBST將OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或貝類(lèi)萃取液稀釋為系列濃度,分別與等體積的單抗混勻,單抗終稀釋度為1∶20000,每孔加入100μL,37℃下保溫1h;棄去殘液,洗板,加入酶標(biāo)二抗,按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦的濃度1∶5000進(jìn)行稀釋,每孔100μL,37℃下保溫1h;洗板3次,每孔加入100μL顯色液,室溫下反應(yīng)10～15min,加入終止液,測(cè)OD450值。2.5elisa標(biāo)準(zhǔn)工作曲線試驗(yàn)結(jié)果如圖抑制率曲線(圖3)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)。抑制率曲線呈“S”分布。當(dāng)OA的濃度低于0.3125ng/mL時(shí),抑制率幾乎降到0,而高于50ng/mL時(shí),OA對(duì)免疫反應(yīng)的抑制效果幾乎一樣,因此,OA濃度的有效檢測(cè)范圍在0.3125ng/mL～50ng/mL之間,在此范圍內(nèi)繪制OA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=0.392x-0.054,R2=0.955,有效線性檢測(cè)范圍為0.3125ng/mL～50ng/mL,IC50為2.59ng/mL,檢測(cè)限為0.45ng/mL。2.6回收率與精密度在OA陰性的貝類(lèi)樣品中分別加入12.5、25、125、500ng/mL的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液,提取后用本試驗(yàn)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行檢測(cè),其回收率與精密度結(jié)果見(jiàn)表1。此方法平均回收率為55.85%,變異系數(shù)為3.03%～8.94%,說(shuō)明該方法重復(fù)性良好,無(wú)需在樣品檢測(cè)時(shí)做更多平行樣。既節(jié)約了試劑成本,又節(jié)約了人力和時(shí)間的消耗。3elisa法檢測(cè)aa中的靈敏度、限和檢測(cè)限目前,國(guó)內(nèi)檢測(cè)OA的方法主要是小鼠法、高效液相色譜法(HPLC)和免疫檢測(cè)技術(shù)(ELISA)。小鼠法簡(jiǎn)便易行,但缺點(diǎn)是受干擾較大,數(shù)據(jù)不精確;HPLC法可準(zhǔn)確分析毒素的含量和種類(lèi),檢測(cè)限可低至ng/g,但樣品前處理過(guò)程復(fù)雜,儀器昂貴,需要專(zhuān)門(mén)人員;ELISA法比HPLC法樣品前處理簡(jiǎn)單得多,特異性好,無(wú)需純化濃縮。另外,ELISA法比HPLC法操作時(shí)間短,一次可處理大量樣品,而且,ELISA法比HPLC法投資小,適合基層單位使用,因此呈現(xiàn)出了較好的應(yīng)用前景,受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。國(guó)外多家公司已開(kāi)發(fā)研制出了檢測(cè)OA的試劑盒,如日本PanapharmLaboratories公司生產(chǎn)的OAELISA檢測(cè)試劑盒檢出限是10ng/mL,美國(guó)柏爾BIOO公司也生產(chǎn)出了OAELISA檢測(cè)試劑盒,但由于價(jià)格昂貴,遠(yuǎn)不適用于我國(guó)商檢部門(mén)的大量應(yīng)用。近幾年國(guó)內(nèi)外均開(kāi)展了許多關(guān)于OA毒素的檢測(cè)研究,如盧士英,用ELISA法檢測(cè)OA的線性范圍為0.4ng/mL～25ng/mL,而本研究的線性檢測(cè)范圍為0.3125ng/mL～50ng/mL,比其檢測(cè)范圍要廣;李?lèi)?ài)峰利用蛋白磷酸酶活力抑制法檢測(cè)OA的最低濃度為0.6ng/mL,TakashiU等建立的ELISA檢測(cè)腹瀉性貝毒方法檢出限為10ng/mL,而本研