中華哲水珩對麻痹性貝毒毒素的攝入及累積規(guī)律研究

中華哲水珩對麻痹性貝毒毒素的攝入及累積規(guī)律研究

浮游動物的毒副反應(yīng)中毒的海洋藻類毒素通過鏈中毒在海洋貝類和魚類中積聚，形成水果或魚毒。通常使用麻痹性苦貝（psp）、腹瀉性苦貝（pd）、神經(jīng)性苦貝（nip）、儲存性苦貝（asp）和硫加魚（cfp）等。其中PSP毒素是世界范圍內(nèi)分布最廣、危害最嚴(yán)重的一類毒素。該毒素是一類四氫嘌呤衍生物,主要成分包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝溝藻毒素(GTX1-4)和N-磺酰胺甲?；惗舅?B1-2、C1-4)等。亞歷山大藻(Alexandriumspp.)是一類能產(chǎn)生PSP毒素的有害赤潮甲藻,廣泛分布于世界沿海海域。在我國黃海、東海及南海海域,均已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生PSP毒素的亞歷山大藻或其孢囊的存在。近幾年我國東海春季大規(guī)模赤潮頻發(fā),產(chǎn)毒的塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)為主要肇事藻之一。浮游動物作為海洋初級生產(chǎn)力(藻類)和次級消費(fèi)者(貝類、魚類等)間的重要傳遞媒介,PSP毒素在其體內(nèi)的累積及排出過程對于該毒素在整個海洋生態(tài)系統(tǒng)中的傳遞具有關(guān)鍵意義。中華哲水蚤(Calanussinicus)是我國近海及日本沿岸海的浮游動物優(yōu)勢種之一,分布廣、數(shù)量多、個體大,在海洋浮游動物種群動力學(xué)中受到廣泛關(guān)注,在中國近海的分布中心是黃海和東海,是該水域春季的主要浮游動物優(yōu)勢種。本文旨在研究C.sinicus對產(chǎn)毒A.tamarense的攝食情況,以及由該藻產(chǎn)生的PSP毒素在C.sinicus體內(nèi)的累積及排出過程。1材料和方法1.1暫養(yǎng)點(diǎn)暫養(yǎng)C.sinicus采自青島近岸海域,以小角毛藻為餌料,持續(xù)較弱充氣,置于培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)數(shù)日。有毒藻選用采自東海的A.tamarense(由一所提供),藻類培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液的改良配方,置于LRH-250G光照培養(yǎng)箱,光源為白色冷日光燈管,光周期L∶D=12∶12。1.2c.singus的體外毒素殘留情況將饑餓24h后的C.sinicus置于1L燒杯中,以1000cells/mL密度加入A.tamarense藻液,將燒杯置于10℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。0～12h為攝食實(shí)驗(yàn),12～15h為饑餓實(shí)驗(yàn),研究C.sinicus體內(nèi)毒素和色素變化;額外增加15～36h饑餓實(shí)驗(yàn),研究C.sinicus在長時間饑餓后體內(nèi)毒素的殘留情況。實(shí)驗(yàn)取樣共有5部分:在0,3,6,9和12h5個時刻取3mL培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),分析藻細(xì)胞密度下降情況;在0,3,6,9,12,12.5,13和15h8個時刻對C.sinicus取樣,每次用寬頭吸管吸出10只用作色素含量分析測定;在0,3,6,9,12,12.5,13,15,24和36h取出10只C.sinicus用作PSP毒素含量分析測定;在12和15h收集燒杯底層全部C.sinicus的糞便進(jìn)行毒素分析測定;在15h取燒杯中培養(yǎng)海水作毒素分析測定。上述5部分取樣實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行兩次平行操作。1.3樣品處理和分析1.3.1高效液相色譜分析C.sinicus及其糞便的PSP毒素提取參照Oshima方法,以醋酸提取,于冰浴中超聲破碎,離心沉降,取上清液過0.45μm濾膜待高效液相色譜(HPLC)分析。培養(yǎng)海水直接以0.45μm濾膜過濾后待HPLC分析。HPLC使用InertsilC8色譜柱,柱溫30℃,流速1mL/min,柱后衍生以高碘酸氧化,醋酸中和。1.3.2c.sicyus體內(nèi)色素含量評價(jià)參數(shù)置于盛有90%丙酮的玻璃勻漿器中研磨,將GF/C膜徹底磨碎后定容至10mL丙酮中萃取色素,24h后,離心沉降,以特納熒光計(jì)測定熒光值求出C.sinicus體內(nèi)(包括消化道和組織中)葉綠素a和脫鎂葉綠酸a含量,并以兩者之和作為C.sinicus體內(nèi)色素含量評價(jià)參數(shù)。葉綠素a濃度:脫鎂葉綠酸a濃度:Pha.a(ng/ind)=0.6633Fd?(Ra?r?Rb)?r?Vn(r?1)(2)Ρha.a(ng/ind)=0.6633Fd?(Ra?r-Rb)?r?Vn(r-1)(2)式中,Fd為量程檔“d”的換算系數(shù),mg/L;Rb為酸化前熒光值;Ra為酸化后熒光值;r為標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a的酸化比;V為提取液的體積,mL;n為C.sinicus個數(shù)。2結(jié)果2.1藻細(xì)胞密度下降如圖1所示,A.tamarense可以被C.sinicus攝食,藻細(xì)胞密度在前3h時間內(nèi)下降速度比較快,至其初始密度的一半以下,在12h時則降至100cells/mL左右。2.2c.singus的銅綠素含量如圖2所示,前12h為攝食實(shí)驗(yàn),12～15h為饑餓實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前C.sinicus體內(nèi)色素含量幾乎為0且未檢出含有PSP毒素。色素分析:攝食實(shí)驗(yàn)前3hC.sinicus體內(nèi)色素含量由0迅速增加至25.0ng/ind,余下的時間內(nèi)含量又逐步下降,在12h降至7.0ng/ind;饑餓實(shí)驗(yàn)開始0.5h內(nèi)色素含量下降幅度最大,降至1.9ng/ind,隨后的2.5h內(nèi)基本保持在這個水平。毒素分析:整個攝食實(shí)驗(yàn)中PSP毒素在C.sinicus體內(nèi)持續(xù)累積,在12h達(dá)到最高值32.6ng/ind;饑餓實(shí)驗(yàn)開始后,C.sinicus體內(nèi)毒素含量迅速下降,0.5h內(nèi)降至25.4ng/ind,為最高值的77.9%,隨后的時間里這種趨勢漸緩,饑餓實(shí)驗(yàn)結(jié)束時毒素含量維持在19.3ng/ind,為最高值的59.2%;在實(shí)驗(yàn)的最后時刻36h,即饑餓實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24h后,C.sinicus體內(nèi)的毒素含量降至8.5ng/ind,為最高值的26.1%。2.3新冠素和型stx、stx、麻黃如圖3所示,A.tamarense在被C.sinicus攝食后,其含有的PSP毒素各成分摩爾百分比發(fā)生了變化:neoSTX、STX、GTXs比例增加,B1-2和C1-2比例下降,而且出現(xiàn)了原本不含有的STX和GTX1-3毒素。例如,攝食實(shí)驗(yàn)開始3h時,C1毒素由4.9%降至2.4%,C2毒素由88.2%降至83.9%,GTX3毒素由0增加至5.4%。在剩余的攝食實(shí)驗(yàn)過程中,各毒素成分摩爾百分比基本維持同一水平。2.4不同的臟器中所含的重金屬毒素含量通過對12h攝食實(shí)驗(yàn)中收集的C.sinicus全部糞便進(jìn)行毒素含量檢測,發(fā)現(xiàn)C.sinicus的糞便中含有PSP毒素,其含量為0.423ng/ind,為12h時刻C.sinicus體內(nèi)毒素累積量最大值的1.3%。而對饑餓實(shí)驗(yàn)后收集的C.sinicus糞便進(jìn)行毒素含量檢測發(fā)現(xiàn),其毒素含量近乎為0,同時對C.sinicus培養(yǎng)海水進(jìn)行毒素檢測,結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)PSP毒素的存在。3浮游動物對浮游動物的釋放釋放可降解所需的合成所釋放的合成所釋放的合成所釋放的合成所釋放的合成所釋放的合成所含的pvc毒素雖然根據(jù)藻細(xì)胞密度變化發(fā)現(xiàn)C.sinicus可以攝食產(chǎn)毒A.tamarense,但是腸道色素分析結(jié)果表明了隨著攝食的開始,C.sinicus對有毒藻的攝入量逐步降低。已有研究顯示,暴露于有毒亞歷山大藻中的紡錘水蚤(Acartiaspp.)會出現(xiàn)活動力減弱以及產(chǎn)卵率下降等現(xiàn)象,本研究可以推斷有毒藻還會對橈足類浮游動物的攝食產(chǎn)生影響。隨著C.sinicus對有毒藻的攝食,PSP毒素在其體內(nèi)持續(xù)累積,直至攝食實(shí)驗(yàn)結(jié)束時達(dá)到了最大含量。Koji等對大森紡錘水蚤(Acartiaomorii)攝食A.tamarense實(shí)驗(yàn)研究表明:在橈足類體內(nèi)毒素濃度達(dá)到10pmol/ind以上時,浮游動物體內(nèi)對PSP毒素的累積量便呈下降趨勢。而在本研究的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),將C.sinicus置于有毒藻A.tamarense環(huán)境中6d時間,PSP毒素在C.sinicus體內(nèi)累積含量高達(dá)37pmol/ind左右,出現(xiàn)此結(jié)果可能是由于浮游動物存在個體大小差異的緣故。A.tamarense被C.sinicus攝食后,其含有的PSP毒素成分間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,這是由于N-磺酰氨甲?；惗舅?B1-2、C1-2)容易脫掉磺?；上鄳?yīng)的氨基甲酸酯類毒素(GTXs、STX、neoSTX等);而GTXs毒素間互為同分異構(gòu)體,β異構(gòu)體毒素GTX3、4易相應(yīng)轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的α異構(gòu)體GTX2、1,C.sinicus體內(nèi)具有一定的酶及酸性環(huán)境,促進(jìn)了這種轉(zhuǎn)化的發(fā)生。C.sinicus停止攝食后,在其糞便中檢測到的PSP毒素為其體內(nèi)含量的1%,且培養(yǎng)海水中也未檢測到毒素,同時,C.sinicus體內(nèi)的毒素含量又在明顯減少,在饑餓實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至24h時,有3/4的毒素消失,這說明C.sinicus可能通過自身的一系列代謝作用使PS