雙殼經(jīng)濟(jì)貝毒安全性評價及分析

雙殼經(jīng)濟(jì)貝毒安全性評價及分析

麻痹性核毒（psp）是一種非常易溶于水的藥物。一些溶解于甲醇和酒精，而不是大多數(shù)非極性溶劑，如乙醛和石油醚。它是一種生物堿,容易從酸性溶液中萃取。來源于貝類攝食海洋中有毒藻類而在體內(nèi)蓄積,主要包括雙鞭甲藻屬Alexandriumspp1,Pyrodiniumspp1,Gymnodiniumspp1,及四種藍(lán)綠藻Aphanizomenonflos–aquae,Anabaenacircinalis,Lyngbyawollei和Cylindrospermopsisraciborskii。該毒素是一類神經(jīng)肌肉麻痹劑,癥狀包括四肢肌肉麻痹、頭痛惡心、發(fā)燒、皮疹等,嚴(yán)重的會導(dǎo)致呼吸停止,已經(jīng)成為國際條約中的化學(xué)武器。目前還沒有針對PSP的特效解毒劑,因此人類攝入超過一定限量時,致死率達(dá)100%。近年來,赤潮、跨洲輪船和近海工業(yè)的污染等方面原因?qū)е露驹丛黾?使得國內(nèi)染毒貝類的面積也增加,貝類的食用安全存在隱患。天津市作為國內(nèi)重要的沿海城市,是重要的水產(chǎn)品批發(fā)集散地,但不曾開展過專項貝類安全的監(jiān)督調(diào)查工作,目前在可查閱的有關(guān)市售貝毒的調(diào)查研究資料更是空白。本文對天津市內(nèi)尖山路水產(chǎn)品批發(fā)市場上銷售的雙殼貝類PSP進(jìn)行抽樣調(diào)查,每月采樣一次,周期為一年,為本地及北方水產(chǎn)品貝類食品的安全性評價提供依據(jù),同時為衛(wèi)生監(jiān)督部門提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1經(jīng)濟(jì)貝類標(biāo)及樣品數(shù)量2011年2月-2012年1月,以月為周期,在天津市尖山路水產(chǎn)品批發(fā)市場采購貝類樣品,時間為期一年,總共采集10種,103個日常食用貝類樣品,銷售量大的主要經(jīng)濟(jì)貝類標(biāo)為每月必采項,再根據(jù)當(dāng)月市售品種變化稍有增加,具體樣品名稱及產(chǎn)地、數(shù)量見表1。每個樣品量為3kg,以保證滿足兩種毒素檢測試驗的出肉率,采集完成后迅速送至樣品前處理室,以清水沖洗貝類樣品外殼,待去除表面泥沙等附著物后,再用解剖刀將其軟組織與殼分離,攪碎后將待檢樣品裝于高密度食品級塑料袋中,抽真空密封,立即放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ａ硗?前處理樣品時蝦夷扇貝、櫛江珧樣品的消化腺與貝肉分離,單獨保存。1.2檢測方法1.2.1小鼠貝樣毒性試驗按照GB/T5009.213-2008貝類中麻痹性貝類毒素的測定方法對所有貝類樣品進(jìn)行提取和檢測。取解凍后樣品100g于1000mL燒杯中,加入0.18mol/L鹽酸溶液100mL,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH為2.0~4.0之間,逐滴勻速加入5mol/L鹽酸溶液或0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整燒杯中混合物pH保持在3.0左右,充分?jǐn)嚢铚睾椭蠓?min,冷卻至室溫后,將混合物移至250mL量筒中加入0.18mol/L鹽酸溶液稀釋至200mL,倒回?zé)?再次調(diào)節(jié)pH至3.0左右,沉降半小時后,取上清液50mL于4000r/min離心5min,取上清液lmL對小鼠進(jìn)行腹腔注射。試驗小白鼠3只為一組,每個樣品注射一組試驗用鼠,稱量小鼠體重精確至0.5g,精確記錄小白鼠注射時刻及死亡時刻。根據(jù)小鼠體重和死亡時間查對國標(biāo)附表,計算毒素含量,毒素含量以鼠單位(Mouseunit,Mu)表示,1個鼠單位(MU)定義為15min殺死1只20g重小白鼠的腹腔注射劑量。取貝肉和消化腺毒素含量的加權(quán)平均值作為貝樣毒性測定結(jié)果。本實驗所用小白鼠全部購自于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,為ICR雄性SPF級,體重均在19~21g之間,許可證號SCXK-(軍)2007-004。1.2.2高效液相色譜法hplc2結(jié)果2.1麻醉性貝毒的檢出情況2011年2月-2012年1月所監(jiān)測的10種,103個貝類樣品中,蝦夷扇貝全年均檢測出PSP陽性,毛蚶在5、6、7月期間結(jié)果呈陽性,波紋巴非蛤在6月中有染毒現(xiàn)象,數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。所檢測的10種經(jīng)濟(jì)貝類中蝦夷扇貝、毛蚶、波紋巴非蛤3種檢出麻痹性貝類毒素,占采樣種數(shù)的30%,總共16個樣品呈陽性,檢出率為16%,陽性樣品中超標(biāo)率為19%(見圖1)。在染毒種類中,蝦夷扇貝12個月均有檢出,檢出率為100%;毛蚶樣品中有3例檢出,分別出現(xiàn)在2011年5、6、7月,占該種總數(shù)的25%;波紋巴非蛤中只有2011年6月獨次檢出,檢出率為8%。全部檢樣毒力范圍分布在49~530Mu/100g之間,根據(jù)FAO及我國漁政漁港監(jiān)督管理局制定的貝類PSP安全食用警戒線400Mu/100g的標(biāo)準(zhǔn),通過消化腺與貝肉加權(quán)平均計算結(jié)果,陽性樣品中共有3個蝦夷扇貝樣品超標(biāo),不得食用,占該貝種超標(biāo)率25%,占所監(jiān)測全部樣品的總超標(biāo)率3%。2.2stx毒素的毒性對檢測出的陽性樣品中2011.5毛蚶和2011.6蝦夷扇貝的消化腺進(jìn)行HPLC檢測,根據(jù)各毒素的毒性值換算為相對于STX毒素的毒性水平(μgSTXeq·100g-1)。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,2個陽性樣品中共檢測出6種麻痹性貝毒成分,其中低毒力的C1、C2檢出率最高,且為毒素中主要成分,分別占總毒性的70.1%和59.2%;而高毒力的STX、GTX1檢出率低,且檢測出少量或未檢出;中毒力的GTX2、GTX3均有檢出分別占總毒力的24.7%和36%。3蝦夷小貝毒的年、月際變化特性產(chǎn)地為大連獐子島的蝦夷扇貝是天津市售貝類中PSP染毒率最高的貝種,其次為唐山拐子莊所產(chǎn)毛蚶,來自山東榮成的波紋巴非蛤亦有一例陽性,2011年6-8月蝦夷扇貝PSP毒力超標(biāo),明顯高于其他月份和種類,期間正值北方夏季,大部分貝類處于生長繁殖期,貝肉肥碩,油脂豐富,消化腺、生殖腺相對膨脹。本項目2011年4、5月份的蝦夷扇貝樣品為全樣檢測,其余月份則是將消化腺與貝肉分開單獨檢測,毒力值以加權(quán)平均表示,消化腺毒力最高值出現(xiàn)在2011年6月份,達(dá)到2332Mu/100g,貝肉均未檢出PSP毒素。在2011年5-7月份,毛蚶和波紋巴非蛤共4例被檢測出陽性樣品,毒力范圍在183~226Mu/100g,均未超標(biāo),但不容輕視,在此期間應(yīng)避免食用含毒貝類,以防發(fā)生任何中毒反應(yīng)。種間PSP含量蝦夷扇貝>毛蚶>波紋巴非蛤>其他。通過本次監(jiān)測,觀察出麻痹性貝類毒素在天津市售貝類中存在著明顯的時空、種間差異。蝦夷扇貝染毒率最高,且毒性最強(qiáng),毒性大小隨季節(jié)的變化而變化,呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性,夏季染毒種類、毒力值均最多且較高,而秋冬季較低,趨勢見圖2,含毒量夏季>春季>秋季>冬季。絕大部分貝類是“非選擇性”的濾食性生物,在貝類的生長過程中,極易攝食海水中的有毒藻類,使有毒生物的毒素在自身體內(nèi)累積和轉(zhuǎn)化,由于南北海域中存在的藻種不同也導(dǎo)致貝體中毒素種類及含量各不相同。本文中HPLC所檢測的兩種陽性樣品僅代表其產(chǎn)地,即唐山拐子莊及大連獐子島地區(qū)。至今為止麻痹性貝類毒素已發(fā)現(xiàn)30種,常用于分析的亦有C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、neoSTX、STX、dcSTX等12種,本文僅具備7種標(biāo)準(zhǔn)品供檢測,故結(jié)果與生物法測定有一定差值,有待進(jìn)一步研究?？傮w來說,麻痹性貝毒在天津市場范圍內(nèi)檢出率及含量整體水平較低,通過對檢測對象差異(貝肉、消化腺)所得到的結(jié)果說明蝦夷扇貝消化腺染毒率高且毒性大,由于毒素在高溫條件下亦不能降解或去除,故食用時應(yīng)將消化腺剔除,操作時切勿破壞腺體,防止毒素污染可食部分。本研究是針對天津市場所銷售雙殼貝類為研究對象,結(jié)果可以直接作為評估市售貝類的污染狀況和食用安全性的依據(jù),夏季是天津市場染毒高峰期,希望能夠提示有關(guān)部門可在春季預(yù)防,在夏季加強(qiáng)對食用貝類的監(jiān)測和宣傳,保證市民健康安全。以O(shè)shima建立的PSP高效液相色譜(HPLC)分析方法為基礎(chǔ),對小白鼠生物法檢測為陽性的樣品,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾,所得濾液作為HPLC分析。采用Agilent1100系統(tǒng)對毒素進(jìn)行分析,色譜柱為AgilentZORBAXEclipsePlusC18反相柱(150mm×4.6mm),柱溫35℃,熒光檢測器為AgilentG1321A,檢測激發(fā)波長330nm,發(fā)射波長390nm。應(yīng)用江天久教授麻痹性貝毒的HPLC分析方法,采用3次等梯度洗脫:第1次分析GTX類毒素,洗脫液為含有3.0mmol/L庚烷磺酸鈉的10mmol/L磷酸銨緩沖液,pH7.1;第2次分析STX類毒素,洗脫液為含有2.0mmol/L庚烷磺酸鈉的30mmol/L磷酸銨緩沖液,pH7.1,并按100∶5(V∶V)的比例加入乙腈;第3次專門分析C類毒素,洗脫液為1.2mmol/L的四丁基磷酸銨