大鼠前庭5-羥色胺1a受體亞型免疫結(jié)構(gòu)的觀察

大鼠前庭5-羥色胺1a受體亞型免疫結(jié)構(gòu)的觀察

大鼠前庭神經(jīng)核綜合體（vlc）是由多個神經(jīng)核組成的腦區(qū)域。位于第四腦室底部。它的尾部很長，從三叉神經(jīng)運動的頭部兩側(cè)到舌下神經(jīng)核的吻部。VNC除接受來自前庭器官的初級傳入以外,與腦內(nèi)許多結(jié)構(gòu),如小腦、脊髓、運動眼球的多個核團等都有纖維聯(lián)系;其功能復(fù)雜、多樣,與軀體定向、身體平衡、眼球運動和前庭-自主神經(jīng)反射等有關(guān)。根據(jù)VNC在腦內(nèi)的傳入、傳出纖維聯(lián)系和化學(xué)神經(jīng)解剖學(xué)等特點,將VNC主要分為前庭上核(superiorvestibularnucleus,SuVe)、前庭外側(cè)核(lateralvestibularnucleus,LVe)、前庭內(nèi)側(cè)核(medialvestibularnucleus,MVe)、前庭下核(inferiorvestibularnucleus,SpVe)以及X和Y兩個細(xì)胞群。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是腦內(nèi)重要的感覺、運動信息調(diào)節(jié)物質(zhì),具有復(fù)雜的生理作用。束路追蹤研究證明,來自腦內(nèi)中縫核簇的5-HT能神經(jīng)元向VNC的許多核團,如MVe、SpVe、LVe和SuVe等都有纖維投射,表明5-HT可通過上述VNC內(nèi)神經(jīng)元上的5-HT受體發(fā)揮其對神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)作用。5-HT對VNC神經(jīng)元的作用,也得到電生理學(xué)的證明,并提示在VNC內(nèi)存在不同的5-HT受體;同時免疫組織化學(xué)和原位分子雜交研究也證明VNC內(nèi)含5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2C等不同5-HT受體亞型。然而,采用離子電滲和微量注射5-HT后,在體對大鼠VNC神經(jīng)元活動所進(jìn)行的記錄表明,5-HT對MVe、LVe和SuVe等核團神經(jīng)元發(fā)揮不同作用,既有抑制又有興奮效應(yīng),5-HT引起興奮和抑制的神經(jīng)元在VNC不同核團內(nèi)的比例有所不同。以上結(jié)果提示,表達(dá)不同5-HT受體亞型的神經(jīng)元比例在VNC各核團有差異。迄今為止,有關(guān)VNC內(nèi)5-HT受體亞型在不同亞核內(nèi)的分布尚缺乏系統(tǒng)的研究資料。5-HT1A受體(5-HT1AR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體,可以介導(dǎo)5-HT對前庭核神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)作用,從而在前庭反射的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。但是,有關(guān)5-HT1AR在VNC內(nèi)的研究卻很局限。例如,原位分子雜交的結(jié)果證明LVe、MVe、SuVe和SpVe內(nèi)的神經(jīng)元在mRNA水平有表達(dá),但在蛋白質(zhì)水平只報道了VNC內(nèi)5-HT1AR在MVe內(nèi)有分布。目前,有關(guān)VNC各核團內(nèi)5-HT1AR在蛋白質(zhì)水平表達(dá)與分布的研究仍缺乏詳細(xì)資料。為進(jìn)一步深入理解5-HT對VNC不同核團神經(jīng)元的作用,本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)對5-HT1AR亞型在VNC內(nèi)的分布進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。材料和方法1.灌流固定、切片實驗采用正常成年雄性SD大鼠6只,體重200～250g(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)。以戊巴比妥鈉(40mg/kg體重)注入腹膜腔麻醉,經(jīng)左心室插管至升主動脈進(jìn)行灌流固定。先用100ml0.05mol/L磷酸緩沖液配制的生理鹽水(PBS,pH7.3)沖洗血液,然后用500ml含4%多聚甲醛和75%(v/v)飽和苦味酸的0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液(pH7.3)灌注固定。灌畢立即取腦干并置于上述新鮮固定液中后固定2～4h,再將腦干移入含30%蔗糖的0.05mol/L的PB中,4℃過夜。最后在冰凍切片機上進(jìn)行連續(xù)冠狀切片,片厚25μm。切片隔2取1,分3套收集于0.05mol/L的PBS(pH7.3)中。2.免疫組化染色用常規(guī)免疫組織化學(xué)方法(ABC法)于室溫下對第1套切片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色?；静襟E如下:(1)豚鼠抗5-HT1ARIgG(1∶1000,Chemicon)孵育24h;(2)Biotin結(jié)合的羊抗豚鼠IgG(1∶200,Vector)孵育4h;(3)ABC復(fù)合物(1∶100,Vector),孵育2h;(4)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和H2O2呈色。上述各步驟之間均用0.05mol/L的PBS(pH7.3)洗片3次,每次10min。其中一抗和二抗用含5%驢血清、0.5%TritonX-100、0.25%角叉菜膠和0.05%疊氮鈉的0.05mol/L的PBS稀釋(pH7.3),ABC用含0.5%TritonX-100的0.05mol/L的PBS稀釋。裱片、室溫干燥、脫水、透明、封片,顯微鏡觀察。第2套切片用于Nissl染色,以便定位免疫組化染色的陽性結(jié)構(gòu)并劃分有關(guān)核團的界限。用正常豚鼠血清代替一抗孵育第3套切片,隨后的步驟與上述染色程序相同,進(jìn)行對照實驗,結(jié)果為陰性。3.核酸陽性神經(jīng)元/細(xì)胞陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/陽性神經(jīng)元/細(xì)胞內(nèi)聯(lián)系5-HT1AR陽性神經(jīng)元計數(shù)來自6只大鼠,每只大鼠每個核團分別記錄吻、中和尾部各3張腦切片上5-HT1AR陽性神經(jīng)元的數(shù)目,在每張切片所計數(shù)的核團內(nèi)隨機取4個(3×104)μm2的樣本進(jìn)行計數(shù),只計數(shù)含細(xì)胞核的陽性神經(jīng)元。數(shù)據(jù)分析時,按照(3×104)μm2范圍內(nèi)5-HT1AR陽性神經(jīng)元的平均數(shù)量,然后描述每個核團吻、中和尾平面神經(jīng)元密度,即以(3×104)μm2內(nèi)陽性神經(jīng)元數(shù)目表示,區(qū)分為:密集(++++,≥10個)、中等密度(+++,7～9個)、低密度(++,4～6個)和稀疏(+,1～3個)四個級別(表1)。核團中5-ht1a免疫陽性神經(jīng)元表達(dá)分布免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,整個VNC從吻側(cè)到尾側(cè)各核團內(nèi)都有5-HT1AR陽性神經(jīng)元分布(Fig.1)。顯微鏡觀察顯示,5-HT1AR免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物彌散分布于胞漿中,也見于部分神經(jīng)元近側(cè)端樹突(Fig.1B～D);陽性神經(jīng)元胞體在不同部位其染色強度有差異,在胞漿中的分布亦不均勻,部分陽性神經(jīng)元輪廓較模糊。此外,在神經(jīng)元胞體和突起中也觀察到點狀的陽性反應(yīng)產(chǎn)物,這些陽性產(chǎn)物的染色強,其分布密度在胞漿中較為均勻;在神經(jīng)元中也觀察到稀疏點狀淡染的陽性結(jié)構(gòu),其在MVe和LVe內(nèi)的密度更大些(Fig.1B,C)。在VNC每個核團,不同的5-HT1AR免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元染色強度有區(qū)別,呈強、中等和弱之分。神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果顯示,VNC各核團之間5-HT1AR陽性神經(jīng)元分布密度不同,MVe內(nèi)陽性神經(jīng)元密度最高,而在其它核團內(nèi)陽性神經(jīng)元密度較為接近;進(jìn)一步觀察到每一核團的吻端、中間部和尾端,免疫陽性神經(jīng)元分布密度基本一致(表1)。SuVe內(nèi)含較多淡染的中、小型多極神經(jīng)元,呈圓形、卵圓形或梭形,散在分布。此核團5-HT1AR陽性神經(jīng)元分布較均勻,但比較而言,其中部密度略高于吻、尾部。MVe的大、小細(xì)胞部均有較高密度的5-HT1AR免疫陽性神經(jīng)元分布,其中小型神經(jīng)元多呈卵圓形、梭形或三角形;MVe小細(xì)胞部多數(shù)神經(jīng)元免疫反應(yīng)產(chǎn)物局限于神經(jīng)元的胞體,個別神經(jīng)元可見較長的陽性突起;大型神經(jīng)元多呈三角形。LVe內(nèi)5-HT1AR免疫陽性神經(jīng)元多呈大多角型,也有較小的陽性神經(jīng)元散在分布;較之其它核團而言,該核團內(nèi)陽性神經(jīng)元突起長而明顯。此核的神經(jīng)元在其全長均呈較低密度分布,但染色較深。SpVe內(nèi)含有深染的大型多極神經(jīng)元,部分神經(jīng)元突起染色明顯;陽性神經(jīng)元在吻、中平面呈低密度分布,尾部呈中等密度分布。X和Y核團內(nèi)均為淡染的中等大小的細(xì)胞組成,呈低密度分布。-ht1a神經(jīng)元概述既往關(guān)于5-HT1AR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布的研究已有較多報道,應(yīng)用放射自顯影和原位雜交技術(shù)進(jìn)行的研究表明,5-HT1AR在腦內(nèi)有較廣泛的分布,而針對5-HT1AR在蛋白質(zhì)水平表達(dá)的資料較少,Kia等采用免疫組織化學(xué)和放射自顯影技術(shù)對全腦的普查結(jié)果表明該受體在MVe有分布,但未說明其在VNC其它核團內(nèi)的分布情況。本研究觀察到5-HT1AR在大鼠VNC各個核團內(nèi)都有分布,這與以往原位雜交的結(jié)果基本一致,提示該受體在VNC的各個核團內(nèi)都介導(dǎo)著5-HT對部分神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)作用。本實驗所觀察到的LVe、MVe和SuVe中有些神經(jīng)元表達(dá)5-HT1AR的結(jié)果與電生理學(xué)實驗結(jié)果相一致,即應(yīng)用離子電滲技術(shù)將5-HT1AR激動劑坦度螺酮(tandospirone)或8-OH-DPAT注入上述核團內(nèi)后,相關(guān)神經(jīng)元對谷氨酸的反應(yīng)會被增強或抑制。Wright等應(yīng)用原位分子雜交技術(shù)表明,LVe、MVe、SuVe和SpVe中都有5-HT1ARmRNA表達(dá),其中MVe內(nèi)mRNA表達(dá)較弱。這一結(jié)果與本研究觀察到的MVe內(nèi)5-HT1AR蛋白表達(dá)最強不一致。究其原因,可能有兩個方面:(1)前者在研究中采用的計量指標(biāo)包含了標(biāo)記強度和陽性細(xì)胞數(shù)量兩個部分,我們只計數(shù)了5-HT1AR免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的數(shù)量;(2)已有研究證明,在腦干的某些核團內(nèi)mRNA表達(dá)的強弱與蛋白質(zhì)表達(dá)之間并不完全呈正相關(guān)性。本研究觀察到5-HT1AR定位于胞體和樹突,以往研究證明,在其它腦區(qū),如前腦的隔區(qū)、大腦皮層、丘腦以及延髓等結(jié)構(gòu)中,5-HT1AR也定位于神經(jīng)元胞體和樹突,兩者結(jié)果一致。由此可見,5-HT可通過胞體和樹突上的5-HT1AR發(fā)揮其對神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)作用。有諸多研究報道,作用于VNC的5-HT來自中縫核簇,其作用可通過VNC神經(jīng)元上表達(dá)的5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2C等受體所介導(dǎo),其中5-HT可激活MVe、LVe與SuVe等核團內(nèi)神經(jīng)元上的5-HT1AR,增強或抑制興奮性突觸傳入引起的興奮性效應(yīng)。LVe和SuVe神經(jīng)元分別與身體姿勢控制和眼球運動有關(guān),細(xì)胞外記錄研究證明,5-HT1AR激活可增強LVe和SuVe神經(jīng)元對谷氨酸的反應(yīng);而MVe神經(jīng)元放電頻率則可被5-HT1AR的激動劑所降低。因此,5-HT1AR介導(dǎo)的效應(yīng)并非一致,這可能與表達(dá)5-HT1AR的神經(jīng)元類型有關(guān)。VNC神經(jīng)元接受來自半規(guī)管和前庭內(nèi)壺腹嵴、橢圓囊斑(球囊斑)等感受器傳來的刺激,感受頭部旋轉(zhuǎn)、直線加速運動。然后,通過將信息傳遞至上位腦中樞不同區(qū)域,如動眼/滑車神經(jīng)核、脊髓、小腦以及腦干等,完成不同生理與行為反射活動。因此,我們推測5-HT1AR介導(dǎo)的不同效應(yīng)很可能與VNC內(nèi)神經(jīng)元的類型關(guān)系密切。識別神經(jīng)元的類型并結(jié)合相關(guān)功能后,再對特定類型的神經(jīng)元上5-HT1AR進(jìn)行研究,將對闡明5-HT1AR的功能有重要意義。關(guān)于VNC神經(jīng)元的5-HT1AR介導(dǎo)5-HT作用的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,目前尚不清楚。據(jù)文獻(xiàn)報道,5-HT1AR介導(dǎo)的神經(jīng)元效應(yīng)存在多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑