自體外周血干細(xì)胞移植糖尿病下肢缺血患者下肢肌肉內(nèi)的骨骼肌重建

自體外周血干細(xì)胞移植糖尿病下肢缺血患者下肢肌肉內(nèi)的骨骼肌重建

0糖尿病下肢活檢細(xì)胞治療糖尿病下肢缺血性疾病是指糖尿病發(fā)展和治療中下肢動(dòng)脈狹窄引起的慢性下肢缺氧。傳統(tǒng)藥物治療效果很低。一些患者的長(zhǎng)期治療效果不理想，尤其是下肢動(dòng)脈流出道關(guān)閉，缺乏代謝支。使用任何藥物都很難將血管連接起來(lái)。隨著干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的進(jìn)展,為糖尿病下肢缺血患者提供了一個(gè)新的治療手段,將干細(xì)胞移植到糖尿病下肢缺血患者的下肢肌肉內(nèi)后,在缺血缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等,形成新生毛細(xì)血管、再生表皮,逐漸分化并形成新的毛細(xì)血管,達(dá)到促進(jìn)血管再生,改善和恢復(fù)糖尿病下肢缺血患者的患肢血流;但采集外周血或骨髓干細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)較大,對(duì)患者年齡、身體條件、心理接受程度要求較高;糖尿病下肢缺血患者多為年齡偏大的老年患者,考慮其自體干細(xì)胞數(shù)量、分化能力下降,且糖尿病患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅數(shù)量減少,而且增殖潛能、黏附和成血管能力均降低。與骨髓和自體外周血干細(xì)胞相比,臍帶資源豐富,間充質(zhì)干細(xì)胞更原始,擴(kuò)增能力更強(qiáng),誘導(dǎo)分化后可獲得足量干細(xì)胞且向血管、骨、肌肉、神經(jīng)分化能力更強(qiáng)大,具有更加有效的干細(xì)胞潛能,且細(xì)胞采集簡(jiǎn)單,以容易獲得、免疫原性弱。本實(shí)驗(yàn)利用糖尿病兔動(dòng)物模型,觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,HUCMSCs)移植對(duì)糖尿病兔缺血下肢血管再生的作用。1人帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植設(shè)計(jì):自身對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn):實(shí)驗(yàn)于2009-12/2010-03在解放軍第463醫(yī)院血液內(nèi)分泌科實(shí)驗(yàn)室完成。材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康日本大耳白兔20只,雌雄各半,體質(zhì)量2.0~2.8kg,六七個(gè)月齡,空腹血糖均低于10mmol/L。購(gòu)自解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)方法:動(dòng)物模型的制備:(1)糖尿病兔模型的建立:用滅菌后的稱量皿精確稱取四氧嘧啶0.60~0.80g,臨用前2min加無(wú)菌生理鹽水12~16mL配成0.05g/mL四氧嘧啶生理鹽水液,四氧嘧啶給藥劑量為115mg/kg;按不同劑量及體質(zhì)量計(jì)算出每只兔所需0.05g/mL四氧嘧啶生理鹽水的體積,將四氧嘧啶經(jīng)耳緣靜脈在30s內(nèi)注射完畢,監(jiān)測(cè)血糖,專人守護(hù)48h防止嚴(yán)重低血糖發(fā)生,觀察血、尿指標(biāo)變化;注射四氧嘧啶后48,72h隨機(jī)血糖(上海強(qiáng)生血糖儀)大于11.1mmol/L確定為糖尿病。(2)下肢缺血模型的建立:成模72h后將糖尿病兔模型給予氯胺酮聯(lián)合氟哌利多麻醉后,自兩側(cè)腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下做一縱行切口行股動(dòng)脈及其分支分離術(shù),分別結(jié)扎并離斷股動(dòng)脈及分支。每只兔左后肢為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植組;右后肢為對(duì)照組,即注射生理鹽水組。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液制備:(1)臍帶的收集:無(wú)菌條件下,收集足月順產(chǎn)或剖腹產(chǎn)健康產(chǎn)婦的臍帶(均為非乙肝、丙肝、艾滋病及梅毒螺旋體抗體陽(yáng)性者),4℃保存,6h內(nèi)處理。(2)臍帶的前期處理:在超凈臺(tái)內(nèi)將臍帶充分洗滌,沖去臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存血并剔除動(dòng)靜脈血管。將臍帶剪成長(zhǎng)度1.0cm小段,經(jīng)勻漿處理至1mm×1mm大小后移至0.1%膠原酶Ⅳ中,置于37℃恒溫振蕩器內(nèi),持續(xù)消化1.0~1.5h,再加入0.25%的胰酶,37℃振蕩消化10min左右,用80~100目濾網(wǎng)過(guò)濾,去除未消化的組織。將含細(xì)胞的濾液進(jìn)行離心洗滌2次。(3)細(xì)胞分離和培養(yǎng):將洗滌后的細(xì)胞接種于含有UltraCULTURE培養(yǎng)液的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中。放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。三四天后,更換培養(yǎng)基,去掉未貼壁細(xì)胞,至細(xì)胞長(zhǎng)到80%~90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型分析(analyzedhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsimmunitysurfacetype):(1)取第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在顯微鏡下觀察。(2)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)CD105、CD90、CD73、CD44,不表達(dá)CD34,CD45,證實(shí)為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。見圖1,2。最后所獲間充質(zhì)干細(xì)胞制備成1×107L-1細(xì)胞懸液5mL待用。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植:糖尿病兔雙下肢缺血模型成模3d后,用1mL注射器將干細(xì)胞懸液分15點(diǎn)(每點(diǎn)平均細(xì)胞數(shù)約為1.67×106L-1)注射于每只兔左后肢內(nèi)收肌和腓腸肌內(nèi);用1mL注射器將5mL生理鹽水分15點(diǎn)注射于每只兔右后肢內(nèi)收肌和腓腸肌內(nèi)。皮溫測(cè)定:于造模前、造模后及干細(xì)胞移植后第2~30天,每天用紅外線皮溫儀(PIC2-POLO多功能紅外線體溫儀,瑞士)測(cè)定兔雙后肢皮溫變化。蘇木精-伊紅染色:將實(shí)驗(yàn)兔充分麻醉后,分別于干細(xì)胞移植術(shù)后第2,4周取雙側(cè)后肢內(nèi)收肌和腓腸肌標(biāo)本3~5塊,冰凍切片甲醇固定,蘇木精染色5min,鹽酸乙醇分化后反藍(lán)15min,伊紅染色3min,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封固。光鏡下對(duì)照觀察雙側(cè)血管分布密度。免疫組織化學(xué)染色測(cè)定毛細(xì)血管密度:干細(xì)胞移植術(shù)后第2,4周取雙側(cè)后肢內(nèi)收肌和腓腸肌標(biāo)本3~5塊,采用SP法,實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,冰凍切片7μm,一抗用博奧森公司CD31抗體,DAB顯色,PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:測(cè)定數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件包分析,以表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)分析。2結(jié)果2.1動(dòng)物的數(shù)量分析2.2兩組皮溫的比較,見表1移植后第15天和第30天移植組皮溫為(36.900±1.745)℃,(37.200±1.770)℃,明顯高于對(duì)照組皮溫(35.800±1.755)℃,差異有顯著性意義(P≤0.05)。2.3血管內(nèi)皮細(xì)胞cd1圖1免疫熒光染色:對(duì)照組未見到經(jīng)DIL染料免疫陽(yáng)性的干細(xì)胞,見圖3;移植組肌間質(zhì)出現(xiàn)大量經(jīng)DIL染料免疫熒光染色陽(yáng)性的干細(xì)胞,見圖4。蘇木精-伊紅染色:對(duì)照組可見少量毛細(xì)血管,見圖5;移植組有大量毛細(xì)血管出現(xiàn),較對(duì)照組毛細(xì)血管數(shù)明顯增多,見圖6。免疫組化染色:血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽(yáng)性,呈棕黃色染色。對(duì)照組可見少量毛細(xì)血管,見圖7;移植組可見大量毛細(xì)血管,較對(duì)照組明顯增多,見圖8。細(xì)胞移植后2,4周,實(shí)驗(yàn)組新生毛細(xì)血管數(shù)目均明顯多于對(duì)照組(P<0.01),見表1。3患者治療糖尿病下肢活檢的效果隨著干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的進(jìn)展,為糖尿病下肢缺血患者提供了一個(gè)新的治療手段,將自體骨髓或外周血干細(xì)胞移植到糖尿病下肢缺血患者的下肢肌肉內(nèi)后,在缺血缺氧環(huán)境下誘導(dǎo)生成血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等,形成新生毛細(xì)血管、再生表皮,逐漸分化并形成新的毛細(xì)血管,達(dá)到促進(jìn)血管再生,改善和恢復(fù)糖尿病下肢缺血患者的患肢血流,從而提高糖尿病下肢缺血的皮膚溫度,緩解下肢疼痛及冷、涼感覺(jué),潰瘍面縮小或愈合。但對(duì)患者年齡、身體條件、心理接受程度要求較高;糖尿病下肢缺血患者多為年齡偏大的老年患者,考慮其自體干細(xì)胞數(shù)量、分化能力下降,且糖尿病患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅數(shù)量減少,而且增殖潛能、黏附和成血管能力均降低;使用其自體或骨髓干細(xì)胞移植方式,擔(dān)心效果不夠理想。而臍帶中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞及造血干細(xì)胞,與骨髓和自體外周血干細(xì)胞相比,臍帶資源豐富,間充質(zhì)干細(xì)胞更原始,分化擴(kuò)增能力更強(qiáng),誘導(dǎo)分化后獲得足量干細(xì)胞且向血管、骨、肌肉、神經(jīng)分化能力更強(qiáng)大,具有更加有效的干細(xì)胞潛能,且細(xì)胞采集簡(jiǎn)單,以容易獲得、免疫原性弱。本實(shí)驗(yàn)將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植到缺血缺氧的糖尿病兔肢體肌肉中,在熒光鏡下觀察,顯示