淺析登革熱的防治

淺析登革熱的防治

病毒登格熱病毒是一種鱗狀病毒科，屬于黃色病毒科，分為den-1、den-2、den-3和den-4。登革熱以埃及伊蚊和白紋伊蚊的叮咬為傳播途徑,人群普遍易感。臨床上主要引起登革熱(DengueFever,DF)、登革出血熱(Denguehemorrhagicfever,DHF)、登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS),其中以DHF/DSS致死率為高,主要發(fā)生于新生兒和二次感染的人群。世界上約有半數(shù)的人口生活在登革熱疫區(qū),每年有超過(guò)5000萬(wàn)的感染病例,其中50萬(wàn)人發(fā)展為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合征,導(dǎo)致2萬(wàn)例患者的死亡。目前臨床尚無(wú)有效的預(yù)防及治療藥物,但近年來(lái),隨著登革熱發(fā)病機(jī)制以及治療方法研究的不斷深入,在登革熱藥物防治方面的研究有了新進(jìn)展。為更好地認(rèn)識(shí)登革熱以及其藥物防治研究現(xiàn)狀、進(jìn)一步研究登革熱的防治,本文主要就登革熱疫苗預(yù)防、小分子藥物和抗體治療方面的研究進(jìn)展以及存在的問(wèn)題作一綜述。1熱病毒的結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生機(jī)制1.1中和性抗體檢測(cè)登革熱病毒為單正鏈RNA病毒,只含有1個(gè)開(kāi)放閱讀框,編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白C,膜結(jié)合蛋白M和包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中,C蛋白包裹病毒RNA,不誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體;M蛋白與E蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性抗體。非結(jié)構(gòu)蛋白可調(diào)節(jié)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制,在病毒的復(fù)制周期中發(fā)揮重要功能:NS1存在于感染細(xì)胞的表面,在病毒RNA的復(fù)制中發(fā)揮重要作用;NS2A可抑制IFN反應(yīng),參與了病毒的組裝;NS2B是一種促進(jìn)因子,在NS3蛋白酶解過(guò)程中發(fā)揮重要作用;NS3發(fā)揮病毒蛋白酶、NTP酶和螺旋酶的作用;NS4A和NS4B調(diào)節(jié)IFN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);NS5蛋白是最保守的蛋白質(zhì),N末端有一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基序,C末端編碼了RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerases,RdRp)。針對(duì)NS的疫苗和單克隆抗體可發(fā)揮保護(hù)性作用。1.2前兩種假說(shuō)的比較關(guān)于DHS/DHF,主要存在3種假說(shuō):第一種為抗體依賴的感染增強(qiáng)作用(antibodydependentenhancement,ADE)。第二種假說(shuō)為細(xì)胞因子風(fēng)暴說(shuō)。第三種學(xué)說(shuō)認(rèn)為登革熱病情的嚴(yán)重程度是由病毒毒株的毒力不同所引起。其他的影響因素還包括:個(gè)人的遺傳因素;受感染時(shí)機(jī)體的免疫狀態(tài)以及不同個(gè)體受感染病毒的量等。其中,前兩種假說(shuō)越來(lái)越為人們所認(rèn)識(shí)。ADE假說(shuō)是由Halstead提出,他早期研究發(fā)現(xiàn),部分抗體能夠發(fā)揮促進(jìn)感染和加重病情的作用,該假說(shuō)認(rèn)為,一型DV感染后產(chǎn)生的抗體能與所有四型的DV起交叉反應(yīng),卻不能發(fā)揮中和作用,而是形成病毒抗體復(fù)合物并通過(guò)IgG的Fc受體(FcR)結(jié)合到單核細(xì)胞系表面,隨著吞噬作用病毒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而增強(qiáng)病毒的感染,其中FcγRⅡ占主導(dǎo)性作用。對(duì)于抗體的ADE的機(jī)制的研究中,Yamanaka等發(fā)現(xiàn)血中補(bǔ)體水平控制著抗體的感染增強(qiáng)作用;Huang等研究發(fā)現(xiàn)Anti-prMAb在無(wú)FcR的細(xì)胞上依然可以通過(guò)分子模擬作用,同時(shí)與登革熱病毒和靶細(xì)胞結(jié)合而介導(dǎo)病毒的感染增強(qiáng)作用。ADE的存在給登革熱的疫苗和抗體的發(fā)展應(yīng)用帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),因?yàn)橛行У囊呙绾涂贵w必須同時(shí)有效抵抗4種血清的病毒,否則可能因ADE而加重疾病進(jìn)展。細(xì)胞因子風(fēng)暴說(shuō)認(rèn)為病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量細(xì)胞因子尤其是TNF-α,能增強(qiáng)登革熱病毒感染的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氮和氧,進(jìn)而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害,引起DHF/DSS的發(fā)生;而抗TNF-α的單克隆抗體能夠降低受攻擊小鼠的死亡率。2藥物保護(hù)的研究2.1價(jià)疫苗:登革熱疫苗理想的登革熱疫苗必須同時(shí)有效針對(duì)4種血清型病毒,對(duì)9~12個(gè)月的嬰兒具有較高安全性,并且能夠提供長(zhǎng)期的保護(hù)性免疫。目前有各種類型疫苗:減毒活疫苗、滅活全病毒疫苗、重組亞單位疫苗、DNA疫苗等。鑒于M和E蛋白包含了主要的中和性抗體表位,用于產(chǎn)生免疫的抗原主要選擇M與E蛋白。減毒活疫苗相比非復(fù)制型的滅活全病毒、重組亞單位疫苗或重組DNA疫苗,能夠更好地誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。因?yàn)樗軌蛱峁﹩蝿┝康目焖倜庖?而不需要多次加強(qiáng)免疫;能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更長(zhǎng)久的中和性抗體,同時(shí)能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體的T細(xì)胞免疫而產(chǎn)生保護(hù);成本較低,便于推廣等優(yōu)點(diǎn),因而作為首選疫苗。目前主要有兩種策略來(lái)開(kāi)發(fā)減毒活疫苗:第一種是采用連續(xù)傳代的方法來(lái)減弱登革熱病毒的毒力,進(jìn)而配伍形成四價(jià)疫苗。這類疫苗有曼谷Mahidol大學(xué)和美國(guó)的WalterReed軍事研究所兩個(gè)小組分別研發(fā)。曼谷Mahidol大學(xué)研制的四價(jià)疫苗,其致反應(yīng)性較強(qiáng),在兒童和成人難于接受。美國(guó)的WalterReed軍事研究所開(kāi)發(fā)并獲準(zhǔn)生產(chǎn)的四價(jià)疫苗,具有較好的耐受性、可接受的致反應(yīng)性以及不產(chǎn)生嚴(yán)重免疫相關(guān)副反應(yīng),目前已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)。第二種策略是利用基因重組技術(shù)制作減毒嵌合活疫苗。將DEN-4的cDNA克隆的3′非翻譯區(qū)進(jìn)行30-nt的缺失突變形成新的減毒株rDEN4Δ30,進(jìn)而將DEN-1、DEN-2和DEN-3的prM/E基因整合入rDEN4Δ30骨架區(qū)的相應(yīng)位置形成登革熱病毒各亞型的減毒疫苗。單價(jià)疫苗單一劑量注射后安全、耐受、較強(qiáng)的免疫原性以及在健康成人體內(nèi)具有遺傳穩(wěn)定性。另一種嵌合疫苗采用了Acambis公司開(kāi)發(fā)的ChimeriVax疫苗技術(shù)。它利用已得到批準(zhǔn)應(yīng)用的17D黃熱病疫苗病毒(YF-VAX;AventisPasteur)作為遺傳骨架,將四型登革熱病毒的E蛋白整合入17DYF-VAX骨架而制成。在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中,首次劑量的單價(jià)ChimeriVax-DEN2具有良好的耐受性以及和YF-VAX相同的安全性。在42個(gè)受試的黃熱病陰性的志愿者中,產(chǎn)生了92%的DEN-2血清陽(yáng)性率,針對(duì)異型登革熱病毒具有較低的交叉反應(yīng)性。目前兩個(gè)主要問(wèn)題阻礙了登革熱活疫苗的發(fā)展:(1)誘發(fā)體內(nèi)中和性抗體滴度不平衡可能致ADE;(2)可能存在的減毒株重新恢復(fù)毒力的問(wèn)題以及可能通過(guò)易感蚊子而傳播。針對(duì)存在的問(wèn)題,還需要在以下方面進(jìn)行努力;對(duì)每株病毒亞型進(jìn)行適當(dāng)減毒以達(dá)到最小致反應(yīng)性和最大的免疫原性,進(jìn)行配伍優(yōu)化以最大程度減少各型減毒病毒之間的干擾及產(chǎn)生相對(duì)均衡的中和性抗體。2.2denv抑制劑直接的抗病毒藥物則可以避免減毒活疫苗存在的潛在問(wèn)題:阻斷病毒生活周期關(guān)鍵步驟的藥物可以同時(shí)阻斷所有型登革熱病毒以及其他黃病毒屬病毒,更為重要的是不必激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)從而避免了ADE的危險(xiǎn)。抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抑制劑早有報(bào)道。這些抗病毒復(fù)合物可分為:多金屬氧酸鹽類和硫酸多糖類。多金屬氧酸鹽類polyoxotungstates能夠體外抑制登革熱病毒的感染而不引起明顯的細(xì)胞毒性;硫酸多糖類復(fù)合物,作為登革熱病毒的受體分子類似物,在人和猴細(xì)胞中能夠抑制DENV-2的吸附和內(nèi)吞?；诜戳xRNA、核酶以及干擾RNA的治療策略則可以靶向登革熱病毒的RNA,針對(duì)病毒復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵性步驟特異性抑制病毒的復(fù)制。RNA沉默(siRNA)在組織培養(yǎng)中展示出了抗登革熱病毒的作用。病毒RNA翻譯后形成的多蛋白體必須經(jīng)過(guò)酶切后才能形成有功能的蛋白,因此,病毒蛋白酶已成為抗病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn),病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS5成為重要靶點(diǎn)。蛋白酶NS3的螺旋酶和蛋白酶活性在病毒復(fù)制和感染中發(fā)揮重要作用,一些天然復(fù)合物,例如環(huán)己烯查耳酮衍生物,能夠有效抑制DEN-2的NS3蛋白酶活性而發(fā)揮體外抗病毒作用。一些模擬蛋白酶的底物類似物可通過(guò)結(jié)合其催化位點(diǎn)從而抑制NS3的蛋白酶活性;含有胍基的復(fù)合物通過(guò)與活性位點(diǎn)的Ser135殘基形成氫鍵來(lái)抑制NS3蛋白酶活性。目前已有一些抑制西尼羅河病毒和日本腦炎病毒NS3螺旋酶的低相對(duì)分子質(zhì)量復(fù)合物,尚沒(méi)有針對(duì)登革熱NS3螺旋酶的藥物。登革熱病毒NS5具有RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerases,RdRp)及甲基轉(zhuǎn)移酶活性,同時(shí)是黃病毒屬病毒結(jié)構(gòu)中最保守的蛋白,是理想的藥物靶點(diǎn)。目前尚無(wú)NS5特異性抑制劑,但其晶體結(jié)構(gòu)已完成,詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息能為小分子藥物的設(shè)計(jì)提供重要依據(jù)。盡管已有一些DENV的抑制劑,但只能抑制病毒生長(zhǎng)繁殖,無(wú)法體內(nèi)清除病毒,其透膜性及特異性尚待提高;缺乏相關(guān)體內(nèi)功能研究。2.3sse的保護(hù)作用病毒性疾病的免疫球蛋白治療是病毒性疾病治療的重要方式,單克隆抗體同小分子化合物相比具有其特殊的優(yōu)越性:高效、特異性強(qiáng),副作用小,不僅能中和病毒,還能通過(guò)CDC和ADCC作用激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)清除病毒。針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白E和M的單克隆抗體均可發(fā)揮中和作用。但E蛋白DIII(EDIII)被認(rèn)為是包含主要受體結(jié)合區(qū)域和保護(hù)性抗體的表位區(qū),針對(duì)EDIII的單克隆抗體可以發(fā)揮小鼠的體內(nèi)保護(hù)作用。Lai等成功成功構(gòu)建了針對(duì)四型登革病毒的黑猩猩Fab抗體庫(kù),先后成功篩選得到了針對(duì)DENV4和DENV1、DENV2的Fab段并與人Fc段連接成功構(gòu)建了人源化嵌合抗體,并利用此抗體成功地保護(hù)小鼠和恒河猴抵抗登革熱病毒的致死性攻擊。單克隆抗體不僅能發(fā)揮中和作用阻斷病毒的黏附,而且能發(fā)揮一定治療作用,在病毒吸附靶細(xì)胞之后依然有一部分抗體能夠發(fā)揮其保護(hù)作用。ADE是單克隆抗體治療的潛在危險(xiǎn)因素。研究人員發(fā)現(xiàn),將抗體Fc段CH2結(jié)構(gòu)域Fc-FcR結(jié)合區(qū)的9個(gè)氨基酸進(jìn)行缺失突變后,可以體外消除抗體的ADE,這一研究可以大大降低單克隆抗體的應(yīng)用危險(xiǎn)。在對(duì)其非結(jié)構(gòu)蛋白的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),針對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS3的單克隆抗體亦能在體內(nèi)發(fā)揮一定抗病毒作用,其保護(hù)機(jī)制尚不十分明確。有研究發(fā)現(xiàn)抗NS1的單克隆抗體可通過(guò)IFN-γ來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用。ADE主要由mAb與病毒表面蛋白結(jié)合而介導(dǎo),而非結(jié)構(gòu)蛋白由于不表達(dá)于病毒表面,從而在一定程度上防止了ADE的產(chǎn)生。但由于體內(nèi)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的保護(hù)作用是有限的,如何更加有效地利用非結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生足夠的保護(hù)作用,也將是研究的問(wèn)題之一。目前兩個(gè)方面阻礙了單克隆抗體的治療應(yīng)用:(1)非人源抗體較強(qiáng)的免疫原性,尚未見(jiàn)有全人源登革熱抗體保護(hù)作用的報(bào)道;(2)ADE的存在。雖然報(bào)道了突變抗體Fc而消除ADE,但體內(nèi)的安全性研究未見(jiàn)報(bào)道。3價(jià)減毒活疫苗的制備方法登革熱發(fā)病人數(shù)逐年增加,臨床并無(wú)有效預(yù)防與治療措施。然而,在登革熱的預(yù)防和治療方面已經(jīng)取得了顯著的成就。目前已有多種有應(yīng)用前景的登革熱疫苗和抗病毒藥物正在開(kāi)發(fā),但尚無(wú)一種正式批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用,仍存在許多亟待解決的問(wèn)題:四價(jià)減毒活疫苗誘發(fā)體內(nèi)中和性抗體滴度的不平衡性、ADE的存在以及病毒毒力的問(wèn)題;抗病毒小分子藥物