病毒噬斑實驗的改良

病毒噬斑實驗的改良

病毒是引起人類疾病的重要病原體。在科學(xué)研究中，最重要的工作之一是確定樣本中的病毒含量。目前檢測方法主要有血凝試驗,病毒噬斑實驗、免疫熒光檢查等傳統(tǒng)病毒學(xué)方法以及PCR等現(xiàn)代方法。這些檢測方法各有其優(yōu)缺點,其中病毒噬斑實驗是比較精確進(jìn)行病毒定量的經(jīng)典方法,被認(rèn)為是檢測病毒含量和感染性的金標(biāo)準(zhǔn)。其對病毒感染性的直觀顯示和測定是其他眾多分子水平的實驗,如PCR,WB(Westernblotting)所不能替代的。病毒噬斑技術(shù)是1952年Dulbecco在研究西方馬腦脊髓炎病毒時建立的,直至今日一直被廣泛應(yīng)用。由于噬斑是由單個病毒顆粒的感染所形成,一般認(rèn)為每個噬斑代表一個病毒感染性粒子,因而該方法是測定病毒數(shù)量和感染力的較為精確的定量方法,同時可用于病毒的純化。另外噬斑的大小反映了病毒的感染性和毒力。病毒滴度是根據(jù)噬斑數(shù)和待測樣本液稀釋濃度進(jìn)行計算,最終得出每毫升病毒原液的噬斑形成單位(plaqueformingunit,pfu),即每毫升樣本試液中含有的具有侵染性的病毒粒子數(shù)(pfu/ml)。病毒噬斑技術(shù)的原理是將各稀釋度病毒接種在單層細(xì)胞上,讓細(xì)胞吸附病毒,然后在單層細(xì)胞上覆以營養(yǎng)半固體培養(yǎng)基,以限制細(xì)胞中感染病毒顆粒的擴(kuò)散,這樣感染就形成局灶病變,即名為“噬斑”(plaque)的退化細(xì)胞區(qū),被感染的細(xì)胞由于不能被活性染料染色,與周圍被染色的活細(xì)胞背景形成鮮明對比而被顯示出來。傳統(tǒng)的營養(yǎng)半固體培養(yǎng)基是含瓊脂糖或瓊脂的培養(yǎng)基,對溫度的要求高,溫度太高影響細(xì)胞和病毒的活性,進(jìn)而影響測定的準(zhǔn)確性;溫度過低又會凝固,對操作者的要求比較高,特別是在多個樣品需要同時檢測的情況下,限制了該方法的廣泛應(yīng)用。因此我們對病毒噬斑法進(jìn)行了改進(jìn),利用甲基纖維素代替瓊脂糖,使方法更簡便而實用,現(xiàn)介紹如下。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)Vero細(xì)胞由本實驗室保存,利用MEM(MinimumEssentialMedium)培養(yǎng)基添加5%小牛血清培養(yǎng),用于病毒噬斑檢測。C6/36細(xì)胞由本實驗室保存,RPMI1640培養(yǎng)基添加10%小牛血清培養(yǎng),用于登革病毒的增殖。登革II型病毒(Tr1751株)分離自登革熱病人,經(jīng)C6/36細(xì)胞增殖,-80℃保存?zhèn)溆谩５歉颕型病毒為2002廣州登革熱分離株,分離自登革熱病人。甲基纖維素(methylcellulose,4000cP)購自Sigma公司,可高壓MEM購自GIBCO公司,小牛血清購自四季青公司,24孔培養(yǎng)板購自Corning公司。細(xì)胞完全培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)基添加5%小牛血清;病毒維持液為MEM培養(yǎng)基添加2%小牛血清。含1.3%甲基纖維素培養(yǎng)基:蒸餾水煮沸后,立即加入甲基纖維素和可高壓的MEM粉劑,搖床上混勻1h,高壓滅菌后,凍融1次,加入5%小牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,10mmol/LHEPES,20mmol/LNaHCO3,混勻備用。飽和結(jié)晶紫的配制:染色用。由溶液A和B組成,配制方法如下:溶液A∶2g結(jié)晶紫加入20ml95%酒精,溶液B∶0.8g草酸銨加入80ml蒸餾水,A、B分別粗濾紙過濾,作為貯備液A、B,熟化1個月以上。使用時A液與B液1∶4混合,混合液為使用液。1.2細(xì)胞培養(yǎng)首日將Vero細(xì)胞傳至24孔培養(yǎng)板中,搖勻,細(xì)胞數(shù)約為1.5×105/孔,待次日長成單層細(xì)胞后使用。1.3維持液與第2管取2ml無菌EP管6只,每只加入1.8ml病毒維持液,取0.2ml病毒液加入第1管內(nèi),混勻;然后取0.2ml加入第2管,混勻,依次稀釋,直到最后一管。注意從高濃度向低濃度稀釋時須更換吸管(圖1)。1.4毒稀釋液的復(fù)孔培養(yǎng)吸去培養(yǎng)孔內(nèi)完全培養(yǎng)液,用MEM培養(yǎng)基輕輕洗1~2次;然后將不同稀釋度的病毒稀釋液分別加入24孔培養(yǎng)板(0.2ml每孔),每一稀釋度做復(fù)孔。同時設(shè)置陰性及陽性對照;然后將24孔板置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h,每15min搖勻1次,使病毒充分吸附。然后吸出病毒液,MEM培養(yǎng)基輕輕洗1次。1.5覆蓋甲基纖維1.6噬斑數(shù)量的確定培養(yǎng)5~8d后,在顯微鏡下觀察噬斑明顯時(不同病毒的培養(yǎng)時間不同),棄去培養(yǎng)基;每孔加入結(jié)晶紫溶液,覆蓋細(xì)胞面,室溫靜置染色30min;自來水緩慢沖洗干凈后,待晾干后觀察結(jié)果,計數(shù)噬斑的數(shù)量,按下列公式計算病毒的pfu。(X1、X2、Xn:表示同一稀釋度在不同培養(yǎng)孔板中數(shù)得到的噬斑數(shù);n表示計數(shù)噬斑而選取的培養(yǎng)板孔數(shù);v表示病毒量(ml);d表示稀釋倍數(shù))2結(jié)果2.1作為待噬斑、干酵母的毒以及染色觀察感染后3d后顯微鏡下可見噬斑(圖2),隨著培養(yǎng)時間的延長,噬斑越來越大,待噬斑增大不明顯時(登革病毒一般是7~8d),進(jìn)行染色觀察。2.2下降型病毒噬斑的形態(tài)感染8d后取出培養(yǎng)板進(jìn)行染色,結(jié)果如圖3所示,空白對照孔(control)均勻染為紫色,登革II型病毒感染所形成噬斑在紫色背景的襯托下十分清晰,且噬斑數(shù)隨著病毒滴度的下降而減少。2.3重復(fù)性與比選如圖4所示,每4個(1~4)相同稀釋度的病毒形成的噬斑數(shù)量基本一致,說明該方法在各個復(fù)孔之間重復(fù)性較好。本實驗室進(jìn)行病毒噬斑測定時一般設(shè)置2個復(fù)孔。2.4會誤差太一般情況下選取肉眼可清楚觀察到噬斑、且噬斑數(shù)為中等的孔進(jìn)行結(jié)果計算,太少則會誤差太大而影響結(jié)果,太多則會由于噬斑間相互融合而難于計數(shù)。以圖5為例,我們分別選取5a的“-5”孔(即1∶105稀釋),5b的“-4”孔進(jìn)行計數(shù),并按前述公式計算,滴度分別為1.9×107和4.15×106pfu/ml。2.5培養(yǎng)板的性質(zhì)圖5a為實驗后保存半年的培養(yǎng)板,而圖5b是保存2年以上的培養(yǎng)板,和圖2a相比,紫色背景略有褪色,但噬斑依然十分清晰,說明利用本方法所完成的噬斑實驗,結(jié)果可較長期保存,便于日后復(fù)查實驗結(jié)果。3甲基纖維素在病毒噬斑實驗中的應(yīng)用病毒噬斑技術(shù)雖然有幾十年的應(yīng)用歷史,但傳統(tǒng)的瓊脂糖或瓊脂的方法在操作上存在不夠簡便等一些問題。最突出的問題是高熔點瓊脂糖鋪細(xì)胞面時的溫度不易掌握,溫度太高會導(dǎo)致細(xì)胞死亡,溫度太低則會提前凝固,使得瓊脂糖不易鋪平、噬斑大小不均,導(dǎo)致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不好判定;低熔點瓊脂糖在做蚊子細(xì)胞28℃培養(yǎng)時效果較好,但在37℃培養(yǎng)箱長時間的培養(yǎng)時,由于環(huán)境溫度與其熔點相近,極易出現(xiàn)融化并從倒置的瓶皿頂部或培養(yǎng)孔中脫落的現(xiàn)象。另外,操作時還需將瓊脂糖放在水浴鍋內(nèi)加溫,邊保溫邊取出加之培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)。再者,就是融化瓊脂糖耗時較長,以上是利用瓊脂糖做噬斑實驗在操作上的不便之處。改進(jìn)后的病毒噬斑法(利用甲基纖維素)具有以下優(yōu)勢:甲基纖維素在80~90℃以上的熱水中迅速分散、溶脹,降溫后迅速溶解,水溶液在常溫下相當(dāng)穩(wěn)定,并且此凝膠能隨溫度的高低與溶液互相轉(zhuǎn)變。具有優(yōu)良的分散性、粘接性和增稠性,恰好能夠固定病毒感染中所形成的病變灶,進(jìn)而形成清晰的噬斑。再有,利用乙醇配制的結(jié)晶紫進(jìn)行染色,固定細(xì)胞的同時染色,省時且操作方便,與中性紅相比,提高了噬斑與深紫色背景對比度,便于觀察和計數(shù)。同時因為細(xì)胞已被固定,可長期保存,便于日后復(fù)查結(jié)果。因此,我們認(rèn)為利用甲基纖維素的病毒噬斑技術(shù)是一個值得推廣使用的、有價值的實驗方法。此外,在實驗中還需注意甲基纖維素的濃度和染色時間的問題。甲基纖維素常用濃度為1%~1.5%,甲基纖維素濃度的選擇對實驗結(jié)果較很大的影響,濃度偏低,因其限制作用較小而無法形成清晰的噬斑,或者形成的噬斑過大而相近的噬斑彼此相連,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性;濃度偏高,則在配制過程中無法均勻混合,并且靜置后無法保持勻質(zhì)的狀態(tài),添加時則會由于過于粘稠不便操作。我們的經(jīng)驗是選擇能限制病毒擴(kuò)散的最小濃度為佳。經(jīng)過反復(fù)摸索,我們認(rèn)為1.2%~1.3%的甲基纖維素粘稠度適中,便于操作,用于登革II型的和日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)的噬斑實驗效果較好。對于染色時間,需視病毒的感染力而定。毒力較強(qiáng)的病毒能夠較快形成噬斑,染色時間應(yīng)提前,毒力弱者