大青葉提取物體外抗登革病毒型的研究

大青葉提取物體外抗登革病毒型的研究

病毒：它們屬于黃毒科黃色病毒。根據(jù)其抗原性，可分為1、2、3和4個(gè)血清型。相同類型的大多數(shù)病毒也有抗原性差異。其中2型傳播最廣泛。登革病毒主要通過白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播,引起登革熱(denguefever,DF)以及發(fā)病率和死亡率很高的登革出血熱(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克綜合征(dengueshocksyndrome,DSS)。這些疾病廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),是一種分布廣、發(fā)病多、危害較大的人類傳染病。近年,在亞洲、非洲和南美洲的熱帶以及亞熱帶地區(qū)登革病毒感染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。我國于1978年在廣東佛山首次發(fā)現(xiàn)本病,以后多次在海南島及廣西等地有發(fā)現(xiàn)。大青葉是一種常用清熱解毒類的中藥,品種甚多,植物來源各異,包括爵床科植物馬藍(lán)、十字花科植物菘藍(lán)及大青、蓼科植物蓼藍(lán)、豆科植物木藍(lán)等的葉,都做為大青葉使用,除木藍(lán)外的根均作為板藍(lán)根使用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為大青葉功能清熱涼血,為解毒要藥,在臨床上應(yīng)用廣泛,對其具體作用機(jī)理進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)報(bào)道也很多,文獻(xiàn)報(bào)道大青葉對乙型肝炎病毒,乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒和流感病毒等均有抑制作用。但對于其抗登革病毒的作用尚未見報(bào)道。本研究對大青葉在體外對DENV-Ⅱ的作用進(jìn)行了初步探討。1阿加強(qiáng)菌病毒的培養(yǎng)水提醇沉法制備的大青葉提取液。由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院病毒研究所提供,生藥液濃度為200mg/ml,抽濾除菌后-20℃保存,實(shí)驗(yàn)用時(shí)以細(xì)胞維持液稀釋成不同應(yīng)用濃度。陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV)粉針劑,0.125g/支,白云山制藥廠生產(chǎn),批號2009020921。白紋伊蚊C6/36細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。細(xì)胞生長液:DMEM培養(yǎng)基(Hyclone產(chǎn)品),加10%新生小牛血清(杭州四季青生產(chǎn)),常規(guī)加100U/ml青霉素,100ug/ml鏈霉素,1%谷氨酰胺。細(xì)胞維持液:除血清降為2%外其余同生長液。DENV-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)毒株,由本實(shí)驗(yàn)室保存。病毒經(jīng)C6/36細(xì)胞活化增殖,細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathogeniceffect;CPE)達(dá)75%以上時(shí)收獲。2細(xì)胞病變程度參照文獻(xiàn),將細(xì)胞懸液稀釋成1×105個(gè)/ml,0.1ml/孔接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置30℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),長滿成單層后棄上清,將DENV-Ⅱ病毒液10倍遞次稀釋成10-1、10-2、……10-8,0.1ml/孔分別加入細(xì)胞內(nèi),每個(gè)稀釋度設(shè)4孔,同時(shí)設(shè)不加病毒液的正常細(xì)胞對照。30℃吸附1.5h,棄上清,換細(xì)胞維持液0.1ml/孔,置30℃5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞病變程度(CPE)并記錄,待CPE穩(wěn)定(約4～5d)后判定結(jié)果,按參考文獻(xiàn)計(jì)算病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。CPE記錄按通用標(biāo)準(zhǔn):-:無細(xì)胞病變;+:25%以下的細(xì)胞出現(xiàn)病變;(++):25%～50%的細(xì)胞出現(xiàn)病變;(+++):50%～75%的細(xì)胞出現(xiàn)病變;(++++):75%～100%的細(xì)胞出現(xiàn)病變。2大青葉提取物對c6/36細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)測得DENV-Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)株的TCID50約為10-6。同上在96孔板上培養(yǎng)細(xì)胞,待長滿成單層后棄去生長液,換用含藥維持液繼續(xù)培養(yǎng)。藥液濃度分別為0.25,0.5,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0mg/ml,每濃度均重復(fù)4孔,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照及陽性藥物對照(ACV組,1.0ug/ml)。逐日觀察CPE并記錄,待各組CPE穩(wěn)定(約5天)后用改良MTT法檢測各孔細(xì)胞存活率。改良MTT法操作步驟參照文獻(xiàn):每孔加入MTT(5mg/ml)20ul,30℃繼續(xù)培養(yǎng)4h,后輕吸棄各孔內(nèi)上清,每孔加入150μlDMSO,振蕩混勻10min,使結(jié)晶充分溶解,測定570nm波長處吸光值(A570)。細(xì)胞存活率(%)=藥物組的A值/正常細(xì)胞組A值×100%;并用直線回歸法算出藥物對細(xì)胞的50%毒性濃度(TC50)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)測得大青葉提取物對C6/36細(xì)胞具有一定毒性作用,如下表1所示,最大耐受濃度約為4.0mg/ml,半數(shù)中毒濃度(TC50)為21mg/ml。將100TCID50的病毒液與藥液等體積混合,藥物終濃度在已測得的最大耐受濃度以內(nèi),分別為0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0mg/ml,每一濃度重復(fù)4孔,在CO2培養(yǎng)箱中于30℃下溫育2h后,將4份同濃度樣品混勻,用維持液進(jìn)行連續(xù)10倍的遞次稀釋。按2.1項(xiàng)中方法測定病毒的TCID50。結(jié)果:不同濃度藥物組的病毒TCID50值與病毒對照組無顯著性差異。說明藥物對DENV-Ⅱ無直接滅活作用。待96孔板內(nèi)的細(xì)胞長滿成單層后,棄上清,加含藥維持液0.1ml/孔,藥物終濃度同2.3,每一濃度重復(fù)4孔,同時(shí)設(shè)未用藥的病毒對照及正常細(xì)胞對照。培養(yǎng)24h后棄上清,用PBS洗細(xì)胞1次,再接種100TCID50病毒0.1ml/孔,30℃吸附1.5h,再棄上清,換維持液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。每日觀察CPE并記錄。結(jié)果:不同濃度藥物組的CPE記錄與病毒對照組無顯著性差異。說明藥物對DENV-Ⅱ吸附細(xì)胞的過程無阻斷作用。待96孔板內(nèi)的細(xì)胞長滿成單層后,棄上清,0.1ml/孔接種病毒,30℃吸附1.5h,再棄上清,換用不同濃度含藥維持液。藥物終濃度在半數(shù)中毒濃度以內(nèi),分別為0.25,0.5,1,2,4,8,16,20mg/ml。每一濃度重復(fù)4孔,同時(shí)設(shè)陽性藥物對照(ACV組,1.0ug/ml)、未用藥液的病毒對照及正常細(xì)胞對照。待病毒對照組CPE達(dá)(+++)時(shí)用改良MTT法測各孔活細(xì)胞的含量,操作同2.2。算出病毒抑制率。病毒抑制率%=(藥物組A值-病毒對照組的A值)/(正常細(xì)胞對照組的A值-病毒對照組的A值)×100%;并用直線回歸法計(jì)算藥物對DENV-Ⅱ在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖的50%抑制濃度(IC50)和藥物治療指數(shù)(TI=TC50/IC50)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)藥物能抑制DENV-Ⅱ的生物合成,其IC50為14.1mg/ml,TI為1.57。見表2。3大青葉抗登革病毒的作用機(jī)制近年來病毒性疾病在世界各地不斷爆發(fā)流行,給人民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展等都造成了巨大影響,故有關(guān)抗病毒藥物的研究一直是國內(nèi)外多年的研究熱點(diǎn)之一。大青葉作為清熱解毒類中藥近年來在臨床上廣泛應(yīng)用,主要用于熱毒發(fā)斑、丹毒、瘡癰腫毒等癥,尤常用于乙性腦炎病毒引起的流行性乙腦的防治。而登革病毒作為與乙腦病毒同屬的黃病毒科中的一種,引起的登革熱在我國南方也時(shí)有發(fā)病,在其治療中也常用到各種解毒中成藥類。本研究初步探討了大青葉抗登革病毒2型的作用效果及機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大青葉提取物在體外不能直接殺滅病毒,對病毒吸附與進(jìn)入細(xì)胞的過程也無阻斷作用,但是對已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒的復(fù)制增殖有一定的抑制作用,且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)藥物劑量效應(yīng)依賴性,即隨著藥物濃度的增高,對病毒復(fù)制增值的抑制作用也增強(qiáng)。根據(jù)本研究所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),算得該大青葉提取物在