刺血療法治療急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型的臨床研究

刺血療法治療急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型的臨床研究

生理性疼痛是由酪氨酸代謝紊亂和排尿減少引起的一組疾病引起的。急性痛風性關節(jié)炎是痛風患者的最常見的首發(fā)癥狀。由于寒冷、飲酒過量、飲食無度等原因致使血清尿酸值發(fā)生波動,從而引起的痛風急性發(fā)作,臨床以受累關節(jié)紅腫熱痛,不能忍受,關節(jié)活動受限為特征［１］。根據2012年的美國風濕病協(xié)會治療和預防痛風的指南［２］,急性痛風性關節(jié)炎的治療是以秋水仙堿及非甾體抗炎藥的應用為主。目前西藥治療本病雖然有一定的療效,但副作用及不良反應較多,使患者難以堅持［３］。臨床已有相當數量的刺血療法治療急性痛風性關節(jié)炎的文獻報道。包括藏醫(yī)在內的其他民族醫(yī)學中的刺血療法報道也提示刺血療法治療本病有操作簡單、療效佳、起效快、副作用少的優(yōu)勢［４－６］。有關刺血療法治療本病的效應機制和作用機制尚缺乏深入探討,難以為臨床推廣提供可靠的科學依據。為此,科學設計和深入研究實屬必要。我們擬對比觀察刺血療法對于急性痛風性關節(jié)炎大鼠模型的局部癥狀、光鏡下形態(tài)學改變、電鏡下超微結構改變的影響,初步探索刺血療法治療本病的效應機制。1材料和方法1.1實驗動物與試劑1.1.1實驗動物SPF級SD大鼠(200±20)g,雄性40只,由遼寧長生生物技術有限公司提供(許可證號:SCXK2010-0001),單籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心,室溫22~25℃,12/12h晝夜節(jié)律,自由進食與飲水,適應性飼養(yǎng)1周。1.1.2主要試劑尿酸鈉(美國sigma公司生產,批號:BCBF1330V)。布洛芬混懸液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產,國藥準字:H19980017),布洛芬含量為20mg/mL。1.1.3主要實驗儀器透射電鏡(日本產JEM-1010)1.2術后處理和隨訪1.2.1尿酸鈉溶液制備稱取0.2g尿酸鈉,充分研磨,加入4mL無菌生理鹽水,制成5%尿酸鈉混懸液,超聲(KQ_500B)振蕩混勻。1.2.2大鼠分組使用隨機數字表將40只大鼠隨機分成4組,分別為正常組10只,模型組10只,布洛芬組10只,刺血組10只。1.2.3模型制備方法使用10%水合氯醛,以0.35mL/100g的劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉。正常組不處理,其他3組大鼠均將右后肢踝關節(jié)擺放成直角,充分暴露出踝關節(jié)與脛腓骨之間的間隙,以45°角從該間隙直插入右后肢背側正中踝關節(jié)與脛腓骨之間的關節(jié)腔。造模的3組均用4號針頭進行關節(jié)腔注射,每次注射前均以75%的酒精消毒。1.2.4治療干預正常組、模型組不做任何治療性干預;藥物組分別于造模后6、24h以布洛芬120mg/kg［７］灌胃;刺血組分別于造模后6、24h在右側昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)［８］,用0.7mm注射器針頭點刺放血(深度約為0.3cm),以自然停止出血為度(先測量關節(jié)周徑再治療)。1.2.5關節(jié)局部癥狀觀察正常組、模型組、藥物組、刺血組在造模前、造模后6、24、48h分別用2~3mm的紙條測量造模踝關節(jié)的周徑,每個時間點重復測量3次,取平均值［９］。1.2.6光鏡病理切片的制備與觀察造模48h后處死大鼠,每組隨機各取5只,剪取右后肢踝關節(jié)(近端和遠端各保留0.5cm),去皮,以10%甲醛固定24h,后用10%硝酸脫鈣3d,每天更換硝酸,完全脫鈣后梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片(厚4μm),常規(guī)HE染色觀察局部關節(jié)腔形態(tài)學改變。1.2.7電鏡標本的制備與觀察造模48h后每組隨機各取2只,剪取右后肢踝關節(jié)腔附近的關節(jié)軟骨,固定于5%的戊二醛中。在4℃冰箱中固定24h后,用PBS沖洗4次,把關節(jié)軟骨放置于10%的鋨酸中放置在4℃冰箱2h,用PBS再沖洗2次,用2%醋酸鈾塊染2h,梯度酒精脫水,浸染樣本,包埋,聚合。透射電鏡下觀察制作好的樣本。1.2.8統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理數據,實驗數據以ue003±s表示。組內比較采用獨立樣本t檢驗;組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1各組大鼠患下肢關節(jié)周徑、周徑變化情況比較由表1可知,正常組4個時間點關節(jié)周徑比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組、藥物組、刺血組造模6h與其造模前周徑比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明造模成功。模型組造模后24h與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明大鼠的造模關節(jié)周徑在6h至24h持續(xù)腫脹,局部癥狀加重;造模后48h關節(jié)周徑分別與造模后6、24h比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),說明造模后大鼠患肢關節(jié)局部癥狀穩(wěn)定,自愈現象不明顯。藥物組造模后24h與造模后6h比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明布洛芬給藥早期(24h內)消除關節(jié)腫脹的效果不明顯;造模后48h與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明布洛芬給藥24h后能改善關節(jié)局部癥狀,消除關節(jié)腫脹。刺血組造模后24、48h的關節(jié)周徑分別與造模后6h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明刺血療法能有效改善關節(jié)局部癥狀,消除關節(jié)腫脹,有起效快、療效持續(xù)的優(yōu)點。造模前各組右后肢踝關節(jié)周徑比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后6h各組間比較,造模干預的3組與正常組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后24h各組間比較,刺血組與模型組、藥物組比較,周徑明顯減小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與正常組比較,關節(jié)周徑無顯著性差異(P>0.05)。造模后48h刺血組、藥物組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。藥物組、刺血組與正常組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.2尿酸鈉結晶沉積正常組的切片顯示關節(jié)腔中未見滲出液,未見炎細胞浸潤,關節(jié)表面光滑,無缺損;模型組的切片顯示關節(jié)腔內有尿酸鈉結晶沉積(粉色團塊狀物體),并有大量炎細胞浸潤;藥物組的切片顯示關節(jié)腔內有部分尿酸鈉結晶沉積(粉色團塊狀物體),并有部分炎細胞浸潤;刺血組的切片顯示關節(jié)腔內有少量粉色團塊狀物體沉積,及少量炎細胞浸潤。見圖1。2.3小鼠骨髓組織結構正常4組關節(jié)軟骨樣本在透射電鏡下觀察,除正常組,其他3組均有不同程度的破壞。正常組細胞正常,線粒體清楚,膠原纖維排列縱橫交錯,不具明顯橫紋或聚集成團狀;模型組關節(jié)軟骨樣本顯示其細胞膜少許破壞,細胞有滲出,突起,內質網擴張,膠原纖維排列亂且密集;藥物組關節(jié)軟骨樣本顯示其細胞有滲出,突起,內質網擴張,線粒體漸少,膠原纖維排列紊亂;刺血組關節(jié)軟骨樣本顯示其細胞有少量滲出,基本細胞結構正常,膠原纖維排列較亂。見圖2~3。3布洛芬給藥及刺血療法的聯合應用療效中醫(yī)學認為血中瘀熱是急性痛風性關節(jié)炎的發(fā)病關鍵。本病臨床發(fā)病以受累關節(jié)紅腫熱痛、活動受限為特點。刺血療法善治熱證、實證、痛癥、急癥,具有清熱、止痛、消腫、祛瘀的直接治療作用,治療本病則更具優(yōu)勢,且符合“菀陳則除之”、“血實宜決之”、“熱則疾之”的針灸治療原則。從上述實驗結果可以看出,使用尿酸鈉關節(jié)腔注射能較好的復制急性痛風性關節(jié)炎模型,關節(jié)腫脹明顯,癥狀能持續(xù)48h且無自愈現象。布洛芬作為非甾體類抗炎藥,給藥后能一定程度減輕炎癥反應,消除腫脹,縮小關節(jié)周徑,但起效時間較晚(給藥18h后起效)。使用點刺放血后,大鼠模型關節(jié)周徑縮小明顯,說明刺血療法對本病有較好的抗炎消腫作用,起效迅速(刺血后即起效)。各組光鏡下觀察右后肢踝關節(jié)形態(tài)學改變可知,急性痛風性關節(jié)炎會有尿酸鈉晶體沉積關節(jié)腔,并伴有大量炎細胞浸潤。布洛芬給藥及刺血療法,均能使關節(jié)腔內尿酸鈉晶體及炎細胞減少。其中,刺血療法對于尿酸鈉晶體沉積及炎細胞浸潤的治療效果更好。各組透射電鏡下觀察關節(jié)軟骨超微結構可知,急性痛風性關節(jié)炎對于關節(jié)軟骨細胞及膠原纖維的損害較大。布洛芬給藥及刺血療法均能改善尿酸鈉對關節(jié)軟骨超微結構的損害,且刺血療法的改善作用更明顯。尿酸鹽結晶對關節(jié)腔