電針不同時間對大鼠脊髓損傷后fa均值的影響

電針不同時間對大鼠脊髓損傷后fa均值的影響

脊柱損傷（rc）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴重損傷。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,亞洲人脊髓損傷發(fā)病率已從12.06/100萬上升到61.6/100萬,平均年齡從26.8歲上升到56.6歲,并且有逐年上升的趨勢。脊髓損傷修復(fù)的研究已成為目前康復(fù)研究的重點。但迄今為止,還未出現(xiàn)有效的臨床治療方法。1994年,Basser等首次在傳統(tǒng)的磁共振成像中應(yīng)用彌散張量成像(diffusiontensorimaging,DTI)。DTI通過測量組織的部分各向異性值(fractionalanisotropy,FA),可在三維空間內(nèi)定量分析組織水分子的彌散能力,是一項可以在體研究中樞神經(jīng)白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的新技術(shù),較磁共振彌散加權(quán)成像(diffusionweightedimaging,DWI)更能準確地反映組織內(nèi)水分子的彌散情況,可以清楚顯示腦與脊髓的細微病理生理變化以及白質(zhì)纖維束的走行、連接和細微變化。利用DTI所獲得的數(shù)據(jù)進行大腦或者脊髓白質(zhì)纖維束成像,即為彌散張量纖維束成像(diffusiontensortractography,DTT)。電針刺激對受損脊髓修復(fù)有正向促進作用。孫迎春等對電針刺激脊髓損傷大鼠的研究發(fā)現(xiàn),頭針加體針治療組的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分優(yōu)于單純頭針或單純體針治療組,尤其是從第4周開始,頭針加體針治療組的BBB評分明顯增高。截止目前,國內(nèi)外關(guān)于電針治療對脊髓損傷后大鼠DTT影響的研究很少,并且沒有相關(guān)脊髓損傷后電針介入治療時間的研究。本研究欲探討不同時間進行電針刺激治療對促進脊髓神經(jīng)修復(fù)的效果及其對DTT中FA均值的影響,探討DTI及DTT技術(shù)在評估脊髓損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)中的臨床應(yīng)用價值。1材料和方法1.1g動物實驗中心90只健康清潔級Sprague-Dawley大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(220±20)g(中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心)。造模成功后,用隨機數(shù)字表法將90只大鼠分為實驗組(n=60)和對照組(n=30),實驗組又分為實驗1組(n=30)和實驗2組(n=30)。本篇論文所用數(shù)據(jù)是實驗中的部分數(shù)據(jù)(n=16)。1.2nu推進治療大鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉35mg/kg,待麻醉生效后,手術(shù)區(qū)備皮,消毒,以T10為中心切開皮膚及皮下組織,暴露T9、T10棘突及椎板,咬除T9~T10棘突、T10椎板,運用NYU打擊器以25g?cm勢能(10g×25mm)撞擊脊髓,撞擊后迅速移開撞擊桿。此時大鼠雙側(cè)后肢及尾部痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱。用生理鹽水沖洗后在受損的脊髓上放一小塊脂肪組織,逐層縫合。切口消毒,立即在背部皮下注射青霉素注射液4×105U和生理鹽水20ml,連續(xù)注射3d。注射后將大鼠置于保溫箱內(nèi)24h后轉(zhuǎn)入單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每天進行4次人工排尿,直至自主排尿建立。1.3干預(yù)方法實驗組接受頭針和體針電刺激。實驗1組3d時開始電針刺激,實驗2組2周時開始電針刺激。對照組不進行任何干預(yù)。1.3.1電針電刺激試驗將大鼠置于固定器內(nèi),待大鼠安靜20min后,針刺運動區(qū)頭皮表面投影區(qū)上2/5,設(shè)定捻針儀每分鐘捻轉(zhuǎn)200轉(zhuǎn);每次捻針3min。接通電針治療儀,正極和負極接運動區(qū)左右針尾,選疏密波2Hz,刺激強度以大鼠后肢輕微顫動為度,每次通電20min。每天1次,共10次。1.3.2單次捻轉(zhuǎn)2.雙側(cè)肝俞穴(T9下兩旁肋間)、脾俞穴(T12下兩旁肋間)、環(huán)跳穴(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣)、后三里穴(膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下5mm處)。將大鼠置于固定器內(nèi),待大鼠安靜20min后,針刺雙側(cè)肝俞穴、脾俞穴、環(huán)跳穴、后三里穴,設(shè)定捻針儀每分鐘捻轉(zhuǎn)200轉(zhuǎn);每次捻針3min。接通電針治療儀,正極接肝俞穴,負極接脾俞穴,正極接環(huán)跳穴,負極接后三里穴,選疏密波2Hz,刺激強度以大鼠后肢輕微顫動為度,每次通電20min。每天1次,共10次。1.4觀察組運動情況不知情的總評價內(nèi)容在安靜的環(huán)境,將大鼠置于2×2×0.5m的BBB評定裝置里,在4min內(nèi)觀察記錄動物后肢的行走及肢體活動情況。評分包括3個部分:第一部分評判動物后肢各關(guān)節(jié)運動及活動度;第二部分評判后肢的步態(tài)及前后肢協(xié)調(diào)功能;第三部分評判運動中足、趾及尾巴的精細動作。滿分為21分。本實驗由對分組情況不知情的專門評價人員對各組實驗大鼠進行評價。分別于SCI后1、2、4周分別由兩名專門評價人員按照BBB評分法評分標準對大鼠后肢運動功能進行獨立評分,左右側(cè)下肢評分不相同時分別記錄獲取數(shù)值,每只大鼠的功能得分取兩人評分均值。1.5dti掃描結(jié)果采用BrukerClinScan7.0T超導(dǎo)型磁共振掃描系統(tǒng)(西門子公司)。實驗組和對照組分別于造模后2~4h、術(shù)后3d和治療后4周進行矢狀面和橫斷面T2WI成像及橫軸面DTI成像。DTI檢查與常規(guī)橫軸面掃描定位相同。DTI掃描采用單次激發(fā)自旋回波平面回波成像序列(echo-planarimaging,EPI),TR5000ms,TE35ms,顯示野36×30,掃描時間225s,層厚0.8mm,彌散加權(quán)系數(shù)b值600s/mm2,彌散敏感梯度20個方向,掃描2次,層距為層厚的30%,矩陣128×128,層數(shù)覆蓋損傷區(qū)域。數(shù)據(jù)處理利用syngoMRB15圖像后處理軟件(西門子公司)。由動物核磁室專業(yè)醫(yī)師(非實驗組人員)按照實驗要求對每只實驗鼠進行DTI和DTT掃描,獲取數(shù)據(jù),并進行圖像處理。由統(tǒng)計人員按照實驗要求進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。1.6測量結(jié)果的描述采用SAS9.2統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學(xué)分析。所有的測量結(jié)果均以(ue0af±s)表示,BBB評分和FA均值各組不同時間點觀測的結(jié)果均用單因素方差分析,兩兩比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1實驗組與對照組的bcb評分比較實驗組和對照組在第1周時各組間BBB評分無顯著性差異(P>0.05)。第4周時實驗組BBB評分顯著高于對照組(P<0.001)。在第2周和第4周,實驗1組顯著高于實驗2組(P<0.001)。見表1。2.2fa值的變化本實驗所得FA信號均值(FA均值)與FA值呈正相關(guān),并可以反映FA值的變化。在2~4h和3d時各組FA均值無顯著性差異(P>0.05)。在第4周時,實驗1組和實驗2組顯著高于對照組(P<0.001),且實驗1組高于實驗2組(P<0.05)。見表2。2.3單次給藥后4周的髓網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)導(dǎo)率圖1~圖6是分別代表各組傷后2~4h和4周的DTT。圖中的顏色代表特征向量運動方向的變化。具體如下:藍色代表上下方向,紅色代表左右方向,綠色代表前后方向。從圖中可以看出在脊髓損傷后2~4h內(nèi),因為脊髓纖維束的斷裂導(dǎo)致脊髓纖維束內(nèi)各個方向的分子彌散運動而呈現(xiàn)出不均勻的紅色和綠色,提示大鼠脊髓纖維束的損傷。從后視(P位)圖中可以看到:各組第4周的脊髓纖維束較傷后均有不同程度的修復(fù),其中實驗組較對照組明顯好轉(zhuǎn)(白箭頭)。體現(xiàn)在:(1)脊髓纖維束神經(jīng)纖維數(shù)目增多;(2)脊髓纖維束均質(zhì)性變好(水分子在脊髓纖維束上下運動呈現(xiàn)出均勻藍色)。3中醫(yī)聯(lián)合特殊治療對髓髓神經(jīng)功能的影響脊髓損傷后,盡可能減少早期病理損害,降低繼發(fā)損傷,提高殘留神經(jīng)纖維存活是減輕和治療脊髓損傷的關(guān)鍵。而受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生與神經(jīng)纖維的生存微環(huán)境等多種因素相關(guān)。有研究報道,電針刺激能夠促進神經(jīng)生長活性物質(zhì)的表達與神經(jīng)的再生與修復(fù),但其機制仍需進一步的研究。實驗組和對照組在第1周時各組間BBB評分無顯著性差異,說明脊髓損傷后1周內(nèi)針灸治療對運動神經(jīng)功能恢復(fù)無明顯影響。這與其他研究一致。分析這可能與早期脊髓損傷后大鼠脊髓水腫炎癥持續(xù)存在有關(guān)。電針后,各實驗組BBB評分顯著高于對照組(P<0.001),說明各種電刺激(針灸)對運動神經(jīng)功能恢復(fù)在2周后能夠出現(xiàn)改善,并且隨著時間延長,有積極的治療作用。推測其機理可能與針刺能明顯地減輕和延緩傷后早期病理損害,擴張血管,改善血管舒縮功能,并且在缺血或再灌期間能進一步上調(diào)活性生長因子的免疫活性表達,使組織間神經(jīng)纖維間的水腫減輕、神經(jīng)保護活性因子表達增強等相關(guān)。在相同時間節(jié)點(第2周和第4周),實驗1組BBB評分顯著高于實驗2組(P<0.001)。提示電針刺激對運動神經(jīng)功能恢復(fù)越早期開始治療,效果越明顯。有研究發(fā)現(xiàn),電針治療急性脊髓損傷大鼠的最佳治療時間為損傷后2h,并認為脊髓損傷后,電針治療應(yīng)及早介入。這與本實驗所得結(jié)論一致。彌散(diffusion)是指分子的隨機不規(guī)則運動,又稱布朗運動(Brownianmotion)。FA反映分子在空間位移的程度,且與組織的方向有關(guān),是水分子各向異性成分占整個彌散張量的比例。其變化范圍為0~1。雖然反映各向異性的參數(shù)有很多,但目前臨床上,應(yīng)用較多的是FA值。但是FA值也有其臨床局限性,體現(xiàn)在以下方面:(1)當(dāng)各本征值同比例改變的時候,FA保持不變;(2)FA值測量具有部位敏感性。本實驗所得FA均值與FA值呈正相關(guān),并可以反映FA值的變化。在2~4h和3d時間點各組FA均值無顯著性差異(P>0.05)。第4周時,實驗組顯著高于對照組(P<0.001),而且實驗1組高于實驗2組(P<0.05)。從FA均值變化趨勢可以看出,FA值的變化也呈現(xiàn)出一個先升高后下降的過程。脊髓損傷初發(fā)時FA值增高,可能與細胞毒性水腫、髓鞘纖維腫脹導(dǎo)致細胞膜通透性減低、細胞外間隙迂曲減小有關(guān)。之后,FA值降低,則與結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致脊髓纖維組織的完整性及方向性喪失、血管源性水腫致細胞外間隙擴大、局部細胞外水腫和/或纖維束中斷、減少有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),髓鞘和神經(jīng)纖維撕裂、細胞外水腫導(dǎo)致Wallerian變性、脫髓鞘改變可能使FA值減低。在第4周時間點上各組之間有顯著性差異,實驗1組、實驗2組FA均值顯著高于對照組(P<0.001),提示針灸在一定程度上減少了脊髓損傷后各種病理改變;實驗1組較實驗2組FA均值也有提高(P<0.05),說明早期介入針灸治療可以最大化的減少脊髓損傷后的繼發(fā)損傷。本實驗證實,傷后FA均值因為繼發(fā)損傷、脫髓鞘改變而降低,針灸在一定程度上減緩此過程,并且早期介入針灸治療,恢復(fù)效果好。本實驗在一定程度上可以認為FA均值可以替代FA值來評價大鼠脊髓損傷的修復(fù)程度,并且可較敏感地反映脊髓神經(jīng)修復(fù)的變化。由于DTT是近年來在DWI基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來的磁共振成像新技術(shù),其名稱尚欠統(tǒng)一。例如有稱為纖維跟蹤技術(shù)(fibertracking)或白質(zhì)纖維束成像(tractography)等。脊髓纖維束彌散張量成像的原理是利用主要特征向量的數(shù)據(jù)映射為顏色而成圖。一般用顏色來表示纖維束走形方向的變化:藍色代表上下方向,紅色代表左右方向,綠色代表前后方向。本實驗中利用這一原理合成DTT。在脊髓受損傷后,因為纖維束的斷裂導(dǎo)致纖維束走形方向的改變,DTT根據(jù)分子沿著斷裂脊髓纖維束的不同方向進行彌散運動而呈現(xiàn)出不同顏色的改變,從而在成像上清晰地顯示出脊髓纖維束的損傷情況。脊髓纖維束的修復(fù)體現(xiàn)在以下方面:(1)脊髓纖維束神經(jīng)纖維數(shù)目增多;(2)脊髓纖維束均質(zhì)性變好(水分子在脊髓纖維束上下運動呈現(xiàn)出均勻藍色)。本實驗中無論實驗組還是對照組,4周后DTT都顯示出纖維束有不同程度的修復(fù),而且實驗組修復(fù)程度明顯好于對照組。4周后實驗1組和實驗2組DTT雖然提示纖維束走形和密度都好于損傷后2~4h,但是并不能顯示出修復(fù)程度上的明顯區(qū)別。分析原因可能與以下方面相關(guān):(1)由于臨近組織的影響以及DTI對磁場不均勻高度敏感等原因,重建的脊髓纖維束圖像長短粗細不均,且無法顯示全長圖像;(2)我們選取的是P位圖即后視圖,在一定程度上增加了分析的難度。本研究是應(yīng)用于大鼠脊髓損傷DTT的前期研究,有很多局限和不足,期待隨后的研究能對在DTT成像參數(shù)和評估纖維束修復(fù)程度上有所改進。雖然本研究是國內(nèi)DTI與DTT技術(shù)應(yīng)用與評價大鼠脊髓損傷模型的前期探索,已顯示出其獨特的效果和優(yōu)越的價值,為下一步的大鼠脊髓損傷基礎(chǔ)實驗研究中的神經(jīng)修復(fù)功能評價上提供更重要的參考價值。4tt的應(yīng)用局限性本實驗結(jié)果顯示,頭體針電刺激對脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生或修復(fù)的影響顯著。并探索性地研究了電針刺激介入的時間,用FA均值的改變來描述和分析脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)情況。從本實驗涉及的不同時間進行電針刺激治療的結(jié)果顯示,傷后電針3d時的治療效果顯著好于2周時的治療效果,提示在臨床治療中針灸治療早期介入效果好。由于入組大鼠和時間點選取較少,可能會對實驗結(jié)果有一定的影響,有待后期更早期并更密集時間點的大型實驗研究。DTT是一種評估脊髓損傷大鼠模型的新型無創(chuàng)影像學(xué)手段。本實驗用其驗證了FA均值在臨床和基礎(chǔ)研究應(yīng)用中的