豬精子頂體蛋白活化調(diào)控的研究

豬精子頂體蛋白活化調(diào)控的研究

豬精尖醇的分子質(zhì)量為32ku，可與頂體素原和頂體素受體結(jié)合。形成的頂素可以誘導儲存反應，并被稱為精煉蛋白32（spermproone32，sp32）。sp32有14個磷酸處理點，其中三個是谷氨酸磷酸化點。即sp32是精子蛋白(Spermprotein,sp)中特異性地結(jié)合前頂體蛋白(Proacrosin)并精細性的調(diào)控獲能及受精的一類蛋白。獲能是受精的一個重要前提,精子蛋白在經(jīng)歷了一系列生理生化的改變和修飾后才具備跟卵子受精的能力,包括前頂體蛋白糖基化,精子脂質(zhì)體改變和cAMP及精子表面負電荷的上調(diào)等。盡管獲能的相關分子機制還不完全清楚,但是精子蛋白以AMP依賴的酪氨酸酸化途徑發(fā)生磷酸化研究已頗多。有研究發(fā)現(xiàn)精子蛋白酪氨酸磷酸化過程可能受cAMP及Ca2+調(diào)控,同時重碳酸鹽、ROS及蛋白激酶亦為動物精子獲能的關鍵因子。S.Tardif等通過體外試驗,將豬精子分別進行獲能培養(yǎng)(即用獲能介質(zhì)與非獲能介質(zhì)培養(yǎng))與離子電滲法誘導頂體反應試驗,然后分別提取精子蛋白,經(jīng)SDS電泳后用抗酪氨酸磷酸化抗體篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過獲能介質(zhì)培養(yǎng)和離子電滲法誘導頂體反應的精子,均可在32ku處出現(xiàn)一蛋白條帶,而非獲能介質(zhì)培養(yǎng)的精子無此條帶,他們將該蛋白稱為P32,并推測P32可能參與獲能。最近J.L.Bailey等利用蛋白質(zhì)組學方法研究P32蛋白酪氨酸磷酸化,并證實P32與獲能相關。與此同時,C.Dubé研究小組將體外制備的豬獲能精子與非獲能精子作對照,提取精子蛋白,經(jīng)SDS電泳后分別用抗酪氨酸磷酸化抗體與抗sp32抗體檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)sp32與P32在電泳圖上有條帶的重疊跡象,再將P32進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜(MS/MS)分析,通過氨基酸序列查詢證實兩種蛋白的序列完全一致,即P32為sp32經(jīng)過酪氨酸磷酸化修飾的蛋白,這種變化伴隨著豬精子的獲能過程。另外sp32與精子頂體蛋白的成熟有非常重要的關系,所以sp32既是一種與精子獲能相關的酪氨酸磷酸化蛋白,也是一種前頂體結(jié)合蛋白。但是sp32作為一種促進前頂體蛋白成熟的結(jié)合蛋白,其具體機制尚不清楚。本研究通過對不同處理的豬精液進行頂體膜蛋白免疫印跡,從分子層面找到sp32表達程度及酪氨酸磷酸化程度對豬精子受精過程調(diào)控的微量關系,進而對研究豬精液的長期保存損傷機制提供一定的參考。1材料和方法1.1保溫杯密封試驗所需豬精液均采自延吉市韓吉牧業(yè)有限公司的健康成年長白公豬。用保溫杯密封避光并且在2h內(nèi)帶回實驗室,運輸過程中將其溫度保持在(24±2)℃,用于試驗的精液必須符合以下條件才可用于試驗:①顏色為乳白色;②活率>80%;③頂體完整性>75%。1.2siga公司D-C6H12O6、NaCl、KCl、NaHCO3、EDTA、檸檬酸二鈉、Na2HPO4、BSA、MgCl2、KH2PO4、CaCl2、Tris和咖啡因等均購自Sigma公司。預染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準(PageRulerPrestainedProteinLadderSM0671)、PVDF膜、免疫印跡一抗(RabbitAnti-Porcinesp32antibody)、二抗(GoatAnti-RabbitIgG(H+L)HRP)、一抗(Mouseanti-Phosphotyrosine)和二抗(GoatAnti-MouseIgG(H+L)HRP)均購于北京華夏遠洋生物科技有限公司。1.3試驗設備電子天平、臺式高速低溫離心機、冰箱、倒置顯微鏡、培養(yǎng)箱、超凈工作臺、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳儀、紫外分光光度計和熒光顯微鏡。1.4稀釋液、提取液和培養(yǎng)基常溫保存液(BTS):D-C6H12O636.9g,NaCl1.191g,KCl0.402g,NaHCO31.260g,EDTA1.247g,硫酸卡那霉素50mg,過0.22μm微孔濾膜消毒,4℃封存待用。PBS:NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4·7H2O1.56g,KH2PO40.24g,青霉素6.00mg,鏈霉素5.00mg,超純水定容至1000mL,過0.22μm微孔濾膜消毒,4℃封存待用。冷凍稀釋液基礎液:D-C6H12O63g,乳糖4g,超純水定容至100mL。冷凍稀釋液:取冷凍稀釋液基礎液78mL,煮沸后加22mL新鮮卵黃,青霉素和鏈霉素各10IU,甘油5mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配。獲能液:NaCl3.31g,KCl0.112g,CaCl20.4739g,Tris1.212g,D-C6H12O60.991g,丙酮酸鈉0.275g,咖啡因0.194g,BSA0.5g,慶大霉素1.0mg,超純水定容至500mL,調(diào)節(jié)pH為7.6～7.8,過0.22μm微孔濾膜消毒,4℃封存待用。0.01mol·L-1PBS溶液:NaCl0.8g;KCl0.20g;Na2HPO40.144g;KH2PO40.02g;加入去離子水,定容至100mL,用0.1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至7.4。膜蛋白提取液:Tris1.21g;NP-400.5mL;NaCl0.7g;MgCl2·6H2O0.087g;EDTA-Na20.0288g;PMSF0.5mL,加入去離子水,定容至100mL。一抗稀釋:用PBS對抗體進行1∶2000～5000稀釋,4℃避光保存。二抗稀釋:用PBS對抗體進行1∶5000～100000稀釋,4℃避光保存。DAB顯色液:DAB6.0mg,PBS10.0mL,硫酸鎳銨0.1mL,H2O21.0μL。1.5精子的提取和制備1.5.1精液的常規(guī)檢測室溫下靜置2h,使精液緩慢降溫到室溫(20～23℃)。用顯微鏡于37℃下進行常規(guī)品質(zhì)檢查。選擇無異味、色澤乳白色、精子形態(tài)正常、活率在0.7以上、密度為“密”精液供試。每頭份精液量,濃稠部分約為80～150mL左右。1.5.2精子活率測定吸取100μL精液樣,滴于預熱的37℃的血細胞計數(shù)板上,蓋上蓋玻片,在20×20的光學顯微鏡下計數(shù)并計算活率。25格×16格的血球計數(shù)板計算公式:精子數(shù)·mL-1=80小格內(nèi)精子個數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù);成活精子數(shù)·mL-1=80小格內(nèi)成活精子個數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù);精子活率=成活精子數(shù)·mL-1/精子數(shù)·mL-1。1.5.3洗精把從豬場取回的豬精液與PBS進行1∶5的比例進行稀釋,1500r·min-1離心10min,重復3次,留沉淀待用。1.5.4精子的獲能用室溫下平衡20min的PBS對洗精后的精液進行1∶1(v/v)混合,500r·min-1離心5min,棄上清,加入2mL獲能液,使精子沉淀懸浮,然后500r·min-1離心5min,棄上清,在沉淀中加入2mL含有終濃度為20μg·mL-1肝素鈉和50μg·mL-1BSA的獲能液,立刻置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱45°傾斜,孵化4h,采用精子上浮(Swim-up)法進行獲能。1.5.5精子的冷凍洗精后的精子和冷凍稀釋液按照1∶2～1∶5比例稀釋混勻后用0.25mL的塑料細管進行分裝并封口,用紗布包裹10～12層,先置于4℃冰箱中預冷平衡3～4h,再放入液氮液面上方5～10cm處10min,最后將樣品完全放入液氮中長期保存。精子的冷凍-解凍處理:從液氮中取出預先冷凍處理的豬精子,放入58℃的水浴鍋中8s,迅速取出。1.5.6精子的頂體反應處理在上浮法獲得的獲能精液中加入溶于DMSO的鈣離子載體A23187(2μmol·L-1),然后孵化30min。1.5.7精液的品質(zhì)檢測1.5.7.1精子活率的測定:取50μL精液放1mLPBS中,再37℃下孵育20min。然后,取20μL滴在保溫37℃的血細胞計數(shù)板上,蓋上蓋玻片,在400×光學顯微鏡下觀察并計算精子活率。1.5.7.2考馬斯亮藍染色(CBB染色法):吸取20μLPBS精子懸液涂片晾干;精子涂片用CBB染色液滴于玻片染30min,三蒸水沖洗玻片,晾干,中性樹脂封片。并在普通光學顯微鏡下進行觀察、統(tǒng)計。1.5.8精子頂體膜蛋白分離取鮮精用0.01mol·L-1PBS洗滌離心,2500r·min-1,3次,每次10min,棄上清液。再用0.01mol·L-1Tris-HCl洗滌離心;2500r·min-1,3次,每次10min,棄上清液,用0.01mol·L-1Tris-HCl溶解沉淀,然后加入膜蛋白提取液進行冰上裂解,1.5h后取出,15000g離心20min,冰上吸取上清液于透析袋中,用磁力攪拌器攪拌,去離子水透析2h,其間換水1次。0.01mol·L-1Tris-HCl透析24h,中間換透析液數(shù)次。將透析后的膜蛋白溶液分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩３恋碛貌缓蠳P-40的膜蛋白提取液洗滌,-20℃保存。1.5.9SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用紫外分光光度計測定各樣品濃度,將各處理組蛋白濃度調(diào)至相同。本試驗蛋白上樣量為45μL,電泳條件為濃縮膠(5%)40mA,分離膠(15%)80mA,電泳3～4h左右。電泳完畢后分膠,放入考馬斯亮藍染色液中,進行染色脫色。平行組凝膠直接進行免疫印跡。1.5.10免疫印跡(Westernblot)剪20張與待轉(zhuǎn)印凝膠大小相等的濾紙和1張PVDF膜,將它們于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min,直到膜之間沒有氣泡存在為止。然后按照陽極、10層濾紙、PVDF膜、凝膠、10層濾紙、陰極的順序依次擺放,使濾紙、凝膠和PVDF膜之間對齊,且確保各層之間沒有氣泡。1mA·cm-2電轉(zhuǎn)印1h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后,用0.01mol·L-1PBS洗膜,之后加包被液,平穩(wěn)搖動,室溫2h。然后棄包被液,用0.01mol·L-1PBS洗膜。加入一抗4℃放置12h,陰性對照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與試驗組相同。棄一抗和1%BSA,用0.01mol·L-1PBS分別洗膜后加二抗,平穩(wěn)搖動,室溫2h。棄二抗,用0.01mol·L-1PBS洗膜。加入顯色液,避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中,終止反應,照相保存。1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)分析使用Excel2007軟件,采用線性方程分析方法檢測結(jié)果。2結(jié)果2.1電泳結(jié)果及準確性分析本研究需要大量反復的應用SDS電泳技術,為確保電泳技術的科學和準確性,最后確定使用15%的分離膠濃度作為本試驗的SDS電泳適用濃度(sp32分子質(zhì)量較小),并對Marker進行了條帶線性方程分析,由R2=0.993可知,該線性方程可用,條帶標記顯示準確(表1和圖1)。2.2豬精子頂部蛋白對豬精子4種方式的處理,并用考馬斯亮藍法進行了精子狀態(tài)染色,結(jié)果見圖2。染色結(jié)果顯示新鮮豬精子頭部蛋白分布較均勻,比較分散,頂體著色不明顯。獲能豬精子頭部蛋白有部分聚集,頂體已經(jīng)明顯著色。冷凍-解凍豬精子頭部蛋白有釋放的現(xiàn)象,頂體顯現(xiàn)脫落或者無著色。頂體反應前期豬精子頭部蛋白更為集中,尤其頂體部分蛋白濃度較高,著色較深。2.3豬精子頂體反應期蛋白表達量將4種處理的豬精子頂體膜蛋白進行SDS,結(jié)果顯示(圖3),豬精子頂體膜蛋白的分子質(zhì)量大部分分布于25ku以上,其中25～38ku之間的蛋白表達量較微弱,而38～170ku之間的蛋白表達效果比較明顯。頂體反應前期的豬精子頂體膜蛋白的表達效果較其他3個處理組明顯,條帶顏色更深。獲能和冷凍-解凍豬精子處理組條帶相似。但是獲能處理組在32ku處條帶沒有冷凍-解凍豬精子處理組的明顯,新鮮豬精子處理組在蛋白質(zhì)分子質(zhì)量38～170ku區(qū)間的蛋白表達條帶較明顯。2.4豬精子質(zhì)量測定sp32蛋白免疫印跡鑒定結(jié)果見圖4,結(jié)果顯示,新鮮豬精子頂體膜蛋白在分子質(zhì)量32ku處有條帶,但是不夠明顯。而獲能豬精子,冷凍解凍豬精子,頂體反應前期豬精子在32ku處條帶顯示明顯。其中獲能和頂體反應前期處理組的sp32表達量高于冷凍解凍豬精子處理組的sp32蛋白表達量。2.5頂體反應前期頂體膜蛋白的酪氨酸磷酸化程度酪氨酸磷酸化蛋白抗體免疫印跡的不同處理組的豬精子頂體膜蛋白組分鑒定結(jié)果見圖5,結(jié)果顯示,新鮮豬精子和頂體反應前期頂體膜蛋白中sp32的酪氨酸磷酸化程度較獲能和冷凍-解凍精子的酪氨酸磷酸化程度低。其中冷凍-解凍精子較獲能精子的sp32酪氨酸磷酸化表達量高,頂體反應前期精子較鮮豬精子的sp32酪氨酸磷酸化表達量高,而頂體反應前期的豬精子頂體膜蛋白中其它分子量的蛋白酪氨酸磷酸化條帶幾乎沒有。3sp32蛋白在豬精子頂體反應過程中的調(diào)控從SDS電泳分離結(jié)果來看,豬精子在經(jīng)過獲能,冷凍-解凍,頂體反應處理后,在保證冷凍-解凍精子活率>30%的前提下,發(fā)現(xiàn)其頂體膜蛋白的表達量較鮮豬精子有較明顯差異,主要表現(xiàn)在鮮豬精子頂體膜蛋白在分子質(zhì)量較大的38～170ku區(qū)間的蛋白表達條帶較其它3個處理組明顯,而其他3個處理組在25～38ku之間的蛋白表達量較鮮豬精子明顯,由此證明,豬精子頂體膜蛋白的組分變化可能與精子受精過程中精子的獲能變化的密切相關。從豬精子頂體膜蛋白組分中sp32的Westernblot結(jié)果來看,隨著豬精子向著獲能過程的變化,精子頂體蛋白中sp32呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律。獲能和頂體反應前期的豬精子頂體蛋白中sp32表達明顯,而鮮精和冷凍-解凍的豬精子sp32表達不明顯甚至很微弱。從豬精子頂體膜蛋白組分的酪氨酸磷酸化蛋白免疫印跡結(jié)果上看,獲能和冷凍-解凍處理組精子的頂體膜蛋白組分的酪氨酸磷酸化程度非常相似,但冷凍-解凍豬精子sp32酪氨酸磷酸化程度最深,這也許從分子層面上說明了冷凍-解凍豬精子雖然和獲能精子有相似的狀態(tài)和生化指標,但是由于冷凍損傷的原因,使得冷凍-解凍豬精子出現(xiàn)受精障礙。頂體反應前期的豬精子頂體膜蛋白僅有sp32的酪氨酸磷酸化條帶依稀可見,這也許與頂體為了穿透透明帶而逐漸發(fā)生頂體反應,相關蛋白降解或者釋放有關系。由此證明,sp32蛋白的表達水平及sp32的酪氨酸磷酸化程度調(diào)控豬精子頂體蛋白的活化,進而影響豬精子的受精率。試驗還發(fā)現(xiàn)新鮮、獲能、冷凍-解凍處理豬精子頂體膜蛋白中分子量在37～40ku蛋白的酪氨酸磷酸化表達呈現(xiàn)特殊的恒定性,這與P.Kalab等、M.M.Bravo等研究證實的豬精子獲能前后40～50ku的蛋白磷酸化程度相對較為恒定非常類似,這種特殊的恒定性可能是對豬精子內(nèi)源自生性酪氨酸磷酸化蛋白體系的又一補充。sp3