登革病毒病毒復制復合體的形成機制

登革病毒病毒復制復合體的形成機制

病毒登格病毒（den）是一種小的動物病毒。它的基因是一種單帶正鏈流的病毒，長約11公斤。由單一的開放讀碼框(openreadingframe,ORF)編碼一個約含3400個氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein),順序為5′-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′,由病毒和宿主蛋白酶負責對其進行協(xié)同翻譯和翻譯后加工,最后形成3個結構蛋白(C、prM和E蛋白)和7個非結構蛋白。20世紀80年代以來,由登革病毒引起的登革熱和登革出血熱在世界范圍的流行、暴發(fā)日益頻繁,我國南方自1978年以來每隔幾年就暴發(fā)一次。為了有效控制登革熱的傳播和流行,必須對病毒的感染及復制周期有一個全面的了解。有關登革病毒生活周期的基礎研究目前越來越深入,本文將對這些研究進展作一綜述。1den病毒中的rgd序列及整合素登革病毒感染的早期現(xiàn)象是病毒的吸附及穿入。病毒吸附蛋白(virionattachmentprotein,VAP)與細胞膜表面特異性病毒受體的結合往往決定了病毒的組織、細胞親嗜性及隨后的一系列病理反應,登革病毒的VAP為包膜蛋白E,含494個氨基酸及2個潛在的糖基化位點,12個保守的半胱氨酸殘基,具有多個中和性表位,其中某些表位可能直接參與病毒包膜與宿主細胞的融合過程,其余的表位可能直接參與病毒-細胞受體分子的結合。在人體內(nèi)DEN病毒侵犯的重要靶細胞類型為單核細胞、組織及骨髓細胞,在這些細胞中較易檢測到高滴度的DEN病毒。DEN病毒與特異性細胞受體的結合依賴于E蛋白的二聚體結構,隨后病毒包膜與細胞膜融合,該過程受包膜附近的低pH介導,使E蛋白的構象發(fā)生改變,由二聚體形成三聚體。對登革病毒E蛋白研究的逐步深入推動了細胞特異性受體的研究。黃病毒中TBE病毒E蛋白通過X射線晶體衍射技術已明確了其三維結構。由于DEN病毒E蛋白與TBE病毒E蛋白具有60%的同源性,通過ProMod及Swiss-Model軟件,可準確預測DEN病毒E蛋白的三維結構如下:E蛋白以延伸的二聚體形式平躺在病毒表面,折疊成3個不同的區(qū)域,Ⅰ區(qū)是一個β-桶狀中心結構,由氨基及羧基端序列產(chǎn)生;Ⅱ區(qū)形成一個延伸的指狀結構,可能與E蛋白二聚體的形成及膜融合過程相關,Ⅲ區(qū)為IgG免疫球蛋白樣折疊,由羧基末端區(qū)形成且延伸至病毒表面,具有與粘附分子中的整合素結合區(qū)域(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),簡稱RGD序列。目前已知口蹄疫病毒(FMDEN)、柯薩奇病毒及腺病毒均通過RGD依賴的方式與整合素結合進入細胞,因此DEN病毒中的RGD序列的存在使人不由想到這些病毒-細胞間的相互作用與整合素的參與有關。而實際情況并非如此,黃熱(YF)病毒17D株的包膜蛋白亦具有一個可溶性的外露RGD序列,最近研究表明將RGD序列突變?yōu)镽AD或RAE序列后,能完全破壞RGD序列與整合素的相互作用,將這些突變引入全長cDNA克隆,體外轉錄后,將突變體RNA轉染C6/36細胞,于30℃培養(yǎng)幾天后,可觀察到細胞病變且培養(yǎng)上清中可檢測到突變病毒子,說明突變的RNA基因組可在蚊細胞內(nèi)復制和傳播;將此培養(yǎng)上清于37℃接種BHK-21細胞并培養(yǎng),BHK-21細胞可被感染,但不能傳播至鄰近的細胞。此外,加入高濃度體外合成的RGD多肽,也不能阻止YFV-17D感染原代雞胚成纖維細胞。這些結果表明RGD序列介導的整合素結合過程在黃病毒與細胞吸附及穿入過程中并不起主要作用。另有實驗表明,MVE病毒在人SW13細胞連續(xù)傳代,獲得的RGD→RGG、RGH突變體是減毒株,究其原因,發(fā)現(xiàn)RGD突變株產(chǎn)生的E蛋白在37℃不穩(wěn)定。以上突變可能影響了E蛋白的折疊過程,也可能使E蛋白不能二聚體化或不能與prM蛋白相互作用,導致了降解,由此可見RGD序列對E蛋白構象的維持起重要作用,但黃病毒的細胞受體并非為整合素。Chen等認為DEN病毒與表達在基質(zhì)及細胞膜上的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)的結合介導了病毒的吸附?？扇苄訥AGs能拮抗重組DEN病毒E蛋白與Vero細胞的結合過程,如肝素的半數(shù)抑制劑量(ID50)為0.3μg/ml,可見E蛋白與肝素具有較高的親和性。由于肝素并非是細胞膜的組成部分,而與其具有結構同源性的硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)廣泛存在于細胞表面及其基質(zhì),它們的一級結構均為重復的二糖單位。也許DEN病毒的靶細胞受體為HS,且HS的硫酸化對E蛋白與受體的結合是必需的。將Vero細胞培養(yǎng)在含氯酸鈉(硫酸化抑制劑)的培養(yǎng)基中,此時細胞的存活性并不受影響,但細胞與E蛋白的結合被抑制?？扇苄缘母叨攘蛩峄疕S能87%拮抗DEN病毒的感染。通過對E蛋白與GAGs的結合序列進行預測(在富含堿性氨基酸的區(qū)域找出被轉角分開的某個區(qū)域,它們?nèi)魧显谝黄饎t認為是GAGs結合序列),得出E蛋白具2個GAGs結合區(qū):E284～310氨基酸,位于Ⅰ區(qū)側面及Ⅲ區(qū)的終端;E386～411氨基酸,位于Ⅲ區(qū)尾部,與前者的C端共同形成暴露在外的受體結合位點,Rey等認為DEN病毒E蛋白(281～423氨基酸)具有潛在的靶細胞結合活性。由于各種細胞來源的HS呈現(xiàn)高度的異質(zhì)性,表現(xiàn)在一級結構及硫酸化水平的差異,對DEN病毒選擇性組織親嗜性也許可以如下解釋:高硫酸化的HS能促進E蛋白的結合與感染,而低硫酸化的HS抑制E蛋白與細胞的結合。但近來的研究表明DEN病毒的穿入也許還需要其他高親和力受體存在,如單純性皰疹病毒Ⅰ型感染成纖維細胞時,其特異性受體為生長因子受體,而HS則作為一個輔助分子起作用。以上研究均是在非人細胞系上進行的。對兩株與DEN-2高度親和的人白細胞系(髓單核細胞系HL60及非EBV轉化的B細胞系BM13674)的研究也表明GAGs參與病毒-細胞間的相互作用,但不可能是唯一方式。Bielefeldt-Ohmann認為肝素是高度帶電分子,它抑制DEN-2與細胞的結合可能是通過非特異性干擾VAP-細胞受體的相互作用而實現(xiàn)的。目前較為合理的解釋是HS使登革病毒粘附至細胞上,粘附作用的增強還需要特異性高親和力受體存在,并最終介導登革病毒進入細胞。登革病毒的另一類受體為病毒特異性IgG及IgM類抗體,抗體分子雖然不是細胞膜表面結構,但仍可作為一類十分特殊的病毒受體介導病毒的吸附和穿入。通常人及靈長類動物的單核巨噬細胞雖可感染DEN,但細胞只能有限度地支持病毒的繁殖。如在細胞培養(yǎng)過程中加入亞中和濃度的抗DEN單克隆抗體,可導致病毒的大量復制,通常病毒產(chǎn)量可增加20～1000倍,這種現(xiàn)象稱為抗體依賴性增強作用(ADE)。其基本原理是:抗體的Fab段與病毒特異結合,而抗體的Fc段則與細胞表面的FcR結合,形成病毒-抗體-細胞復合體,從而介導病毒的感染,當然,ADE作用并不是登革病毒獨有的,幾乎所有的抗病毒表面抗原表位的抗體均有不同程度的ADE作用,其發(fā)生依賴于感染細胞表面存在的FcR。此外,補體受體(C3R)也能引起登革病毒感染增強作用。2病毒rna的形成DEN病毒的復制過程發(fā)生在感染細胞胞漿,正鏈RNA合成的循環(huán)模板是復制型(RF)RNA,為雙鏈RNA(dsRNA),在病毒復制周期中正鏈RNA大約是負鏈RNA的10～100倍。在DEN-2病毒感染細胞中可觀察到病毒誘生的膜結構。通過免疫金標記及一系列的生化分析表明KUN病毒感染Vero細胞后,能誘生一系列獨特的膜結構,病毒的復制復合體(replicationcomplex,RC)存在于膜泡群(vesiclepackets,VP),由dsRNA及NS1、NS2A、NS3、NS4A與NS5蛋白組成,此外,特異的細胞蛋白(如eF1-α可與3′NTR端的SL結構相互作用)也可能參與病毒的復制過程。黃病毒誘生的膜結構雖然早有報道,但長期以來對這些膜的細胞內(nèi)起源及其在感染中所起的作用并不了解。最近采用免疫熒光及冷凍免疫電鏡技術顯示NS2B及NS3(病毒蛋白酶復合體)與NS4A共定位于誘生的卷曲膜(convolutedmembranes,CM)及次晶態(tài)排列(paracrystallinearrays,PC),而復制復合體定位于VP。其他蛋白如C蛋白及NS4B則與增殖的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相連,然后再轉位至胞核。進一步對KUN病毒感染后的膜形成動力學進行研究,發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)存在膜成分的重排,包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)、中間腔(intermediatecompartment,IC)及反式高爾基體的膜成分。重排或誘生的結構具物理上的連接,并且在病毒復制周期中有各自明確的功能。正鏈RNA的翻譯發(fā)生在RER,首先產(chǎn)生多聚蛋白前體,隨后在ER腔進行信號肽的切割,CM及PC膜結構中存在的NS2B/NS3蛋白酶對大部分NS區(qū)蛋白的切割產(chǎn)生單個的NS蛋白,它們可仍然滯留于CM/PC(如NS2B、NS3及NS4A)內(nèi),也可進一步轉運至VP(如NS1、NS3、NS5、NS2A及NS4A),或者移至胞核(NS4B)。病毒蛋白從RER向高爾基體的運動對膜的誘生是必需的,CM膜與PC膜可相互轉換,它們均來自IC,而VP膜則誘生于反式高爾基體的膜成分。位于VP膜內(nèi)的復制復合體又是如何形成并啟動負鏈RNA的合成呢?這方面的研究得益于穩(wěn)定的KUN感染性全長cDNA克隆FLSDX的建立及能永久表達KUN病毒復制子RNA的BHK細胞系repBHK的建立,前者使突變基因的引入變得容易,后者則有利于反式互補作用的研究。KUN病毒復制子RNA為缺失了病毒的大部分結構區(qū)基因(僅保留了C蛋白的前60個核苷酸)的亞基因組RNA,能在轉染細胞中復制,這說明RNA的復制只需NS蛋白即可。對黃病毒NS1蛋白亞細胞定位顯示大部分NS1緊密結合在病毒誘生的VP膜上,Muglaert等進一步證實了YFV-NS1溫度敏感突變株能阻斷其基因組RNA的擴增。黃病毒NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶(serineprotease)活性及核苷三磷酸酶活性(nucleosidetriphosphatase,NTPase)、RNA解旋酶活性(RNAhelicase),前者的功能結構域位于NS3蛋白N端的1/3區(qū),主要負責多聚蛋白的翻譯后加工,產(chǎn)生成熟的病毒蛋白,這是病毒自我復制和組裝的前提條件;后者的功能域位于C端的2/3區(qū),主要參與病毒RNA的復制過程。黃病毒NS5蛋白具有非特異性RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性,包括8個保守的RdRp序列,其中之一為GDD序列(Gly-Asp-Asp),另有2個保守的具甲基轉移酶特性的MT序列,在全長cDNA克隆FLSDX中分別缺失GDD序列和一個MT序列(S-腺苷甲硫氨酸位點),產(chǎn)生FLdGDD、FldSAM構建體,將它們的體外轉錄本導入BHK細胞,結果這些RNAs完全失去復制能力,可見GDD序列及MT序列對NS5功能的發(fā)揮是必不可少的。如果將它們的體外轉錄本導入repBHK細胞,則可產(chǎn)生僅能在repBHK細胞中復制的缺失病毒。這是因為repBHK細胞內(nèi)能穩(wěn)定產(chǎn)生輔助復制復合體,缺失GDD及MT序列形成的缺失型復制復合體能與輔助復制復合體有效地交換成分,其中的輔助NS5可結合至缺失RNA模板啟動復制。通過對KUN病毒NS5基因的進一步缺失研究表明,將感染性全長cDNA克隆NS5基因羧基端5%、34%、56%的區(qū)域缺失后,體外轉染repBHK細胞,均有缺陷病毒分泌,其中將NS5基因羧基端缺失56%的構建體缺失了全部的RdRp區(qū)。而將缺失NS5基因氨基端的構建體轉染repBHK細胞后,NS5的功能不能被有效互補。通過比較黃病毒NS5蛋白N端的氨基酸序列,找到了3個高度保守區(qū):a區(qū)(141～151氨基酸),b區(qū)(203～223氨基酸),c區(qū)(343～365氨基酸),這3區(qū)缺失的RNA不能在repBHK細胞復制。由此可以設計一個這樣的復制模型(圖1,2):在翻譯過程中,黃病毒NS5蛋白的N端通過保守序列(a區(qū)、b區(qū)、c區(qū))與NS3和NS2A相互作用,于基因組RNA的3′NTR啟動復制復合體的形成。然后RNA模板與已形成的不成熟復制復合體運輸至VP膜上某個錨定區(qū),以形成完整的復制復合體,并在此處啟動負鏈RNA的合成。復制復合體一旦形成即以活性狀態(tài)穩(wěn)定存在,不需要新翻譯的NS蛋白的補充。NS2A的作用可能是將病毒的RNA及復制復合體靶向VP膜,NS4A是一個跨膜蛋白,以二聚體形式存在,NS1與NS4A的腔內(nèi)部分直接結合,可誘導NS4A的構象發(fā)生變化,然后NS4A及NS2A通過疏水相互作用結合,形成的完整復制復合體發(fā)生結構重排,使其中NS5的RdRp區(qū)與正鏈RNA結合,啟動負鏈RNA的合成。根據(jù)上述推測的復制模型可以看出,缺失NS5蛋白的C端并不阻止它與其他NS蛋白的相互作用,但最終形成的是缺陷型復制復合體。通過互補實驗發(fā)現(xiàn)缺陷型復制復合體仍能將缺失了NS5基因C端的RNA運送至repBHK細胞內(nèi)輔助復制復合體合成位點,此過程可能由NS2A引導。缺陷型復制復合體通過與輔助復制復合體或其中成分交換,從而啟動缺失了NS5基因C端的負鏈RNA合成。該模型是否真實反映了黃病毒的復制事件尚需進一步的實驗證實。3檢查病毒幾何質(zhì)量及重組病毒顆粒DEN病毒的核衣殼由衣殼蛋白C及基因組RNA構成,其中C蛋白含大量的Lys和Arg殘基,這些堿性氨基酸可部分中和RNA的負電荷。使用DEN-2及DEN-4衣殼蛋白C的單克隆抗體可檢測到C蛋白存在于感染細胞的胞漿、胞核膜及核內(nèi),目前對C蛋白具有的核定位位點重要性及其與病毒形態(tài)發(fā)生的關系尚不清楚。DEN病毒組裝的第一步發(fā)生在ER膜相關位置。C及PrM蛋白連接處的內(nèi)部信號序列指導prM蛋白穿越ER膜并定位于ER腔。NS2B/NS3催化C蛋白羧基端在胞漿側的切割,此過程使以隱蔽構象存在的prM信號肽在轉位通道前后作布朗運動,然后被位于ER膜腔側的信號肽酶識別。同樣prM-E連接處的切割也由ER內(nèi)的信號肽酶介導。如果將prM信號肽的羧基端用理想的信號肽酶識別序列VPQAQA取代,可使C-prM連接處無需先經(jīng)NS2B/NS3在胞漿切割,信號肽酶即可發(fā)揮作用,結果發(fā)現(xiàn)信號肽酶對prM的切割功能的確加強了,同時感染性病毒顆粒的產(chǎn)量也大大降低。進一步研究表明,VPQAQA突變體并不影響病毒復制的早期過程(病毒RNA及蛋白質(zhì)合成),可能影響的是發(fā)生在ER膜上黃病毒的組裝。該突變體導致C蛋白以膜錨定形式存在,可能它不能作為NS2B/NS3的底物,這對病毒的組裝影響極大,因為錨定蛋白是病毒粒子C蛋白的前體,前者向后者的轉換可啟動核衣殼在胞漿的組裝。DEN病毒粒子組裝的第二步是形成一個未成熟顆粒,E蛋白與prM蛋白非共價相連成異源二聚體,其中prM起伴侶分子的作用,可阻止未成熟病毒顆粒在通過酸性膜泡分泌過程中,E蛋白構象發(fā)生不可逆變化。隨后prM蛋白內(nèi)部,受宿主弗林蛋白酶(furin)的切割,裂解產(chǎn)生M蛋白,引發(fā)病毒顆粒表面的E蛋白形成同源二聚體,最終產(chǎn)生成熟的病毒顆粒。只有含M蛋白的病毒顆粒才能介導病毒與細胞間在酸性pH條件下的融合。初步認為登革病毒顆粒組裝過程如下:在蛋白合成過程中E、prM插入RER膜;C蛋白與病毒的RNA在胞漿中裝配成核衣殼,并集中于ER膜的細胞漿側。核衣殼可能通過芽生方式獲得包膜,非成熟病毒顆粒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組裝,然后進一步轉運到反式高爾基體,對E蛋白及prM蛋白的糖側鏈進行加工,通過細胞分泌途徑運輸至胞外。在釋放前,prM裂解產(chǎn)生M蛋白,E蛋白同源二聚體化形成成熟的病毒顆粒。登革病毒prM、E蛋白糖側鏈的加工對病毒糖蛋白的正確折疊有重要意義。DEN-