骨髓間充質(zhì)干細胞肌肉注射移植誘導(dǎo)大鼠糖尿病下肢缺血

骨髓間充質(zhì)干細胞肌肉注射移植誘導(dǎo)大鼠糖尿病下肢缺血

1骨髓細胞處理和轉(zhuǎn)歸示蹤設(shè)計：自身的動物比較試驗。時間及地點:于2009-09/2011-02在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室完成。材料:實驗動物:清潔級SD大鼠共50只,其中兩三周齡20只,雌雄不拘,用于BMSCs的制備,另外30只成年雄性SD大鼠,體質(zhì)量180~250g,用于糖尿病后肢缺血模型制備。全部動物均購自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實驗中心,許可證號:SCXK(渝)2007-0005,并在專用動物室清潔環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗所采用的動物實驗操作程序經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審議批準(zhǔn)。主要試劑與儀器:方法:大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng):頸椎脫臼法處死兩三周齡SD大鼠20只,無菌條件下取下兩側(cè)完整股骨,浸入體積分數(shù)0.1%新吉爾滅15min,剝離股骨附著肌肉,用含雙抗的D-PBS反復(fù)清洗;剪開股骨兩端,用D-PBS沖洗骨髓腔,收集含骨髓細胞的洗脫液,1000g離心5min,棄上清,細胞沉淀用含終濃度為10μg/LbFGF、體積分數(shù)10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基再懸浮,每只大鼠分離的骨髓細胞接種兩個T25培養(yǎng)瓶,置37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2d換液1次,同時洗脫未貼壁的血細胞,當(dāng)BMSCs生長匯合度達60%~70%時,采用胰蛋白酶消化法,按2×108L-1細胞濃度進行傳代培養(yǎng)。模型BMSCs移植:采用模型大鼠自身對照,注射量參考文獻的方法進行:BMSCs移植操作如下:取2×106個第3代BrdU標(biāo)記BMSCs,用250μL生理鹽水制成單細胞懸液,自左側(cè)股動脈離斷處起分10個點將干細胞懸液注射入左后肢股直肌和腓腸肌中;右后肢相應(yīng)部位注射等量生理鹽水作為對照。數(shù)字減影血管造影(DSA):隨機選取糖尿病模型大鼠及移植BMSCs后2,6周模型大鼠,經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后沿腹正中線偏右縱行切開腹壁全層,顯露腹主動脈,動脈夾夾閉近心端,于動脈夾和腹主動脈分叉之間順行穿刺插管,采用30%碘海醇,以1mL/s速度、111kPa壓力注入4mL對比劑,進行雙后肢DSA檢測。毛細血管密度變化分析:取移植后2周模型大鼠雙側(cè)股直肌和腓腸肌,40g/L多聚甲醛固定24h,橫切股直肌和腓腸肌為2~5mm厚的組織塊,進行常規(guī)石蠟包埋,切片(厚5μm),經(jīng)蘇木精-伊紅染色后置光鏡下觀察,隨機選取400倍下10個視野,分別統(tǒng)計股直肌和腓腸肌的毛細血管數(shù)和肌纖維數(shù),以兩者比值計算毛細血管密度。BrdU標(biāo)記BMSCs的體內(nèi)示蹤:取材及石蠟包埋、切片同上步驟所述。采用小鼠來源BrdU一抗結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體免疫組織化學(xué)法,經(jīng)DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹脂封固后,置光鏡下觀察BrdU標(biāo)記BMSCs移植細胞的體內(nèi)存活與組織整合情況。主要觀察指標(biāo):BMSCs生長情況及BrdU體外標(biāo)記率;BMSCs移植糖尿病后肢缺血模型的血流重建;移植細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)歸示蹤與血管新生。統(tǒng)計學(xué)分析:由第一作者用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗數(shù)據(jù)以_x±s表示,采用t檢驗。P<0.05表示差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1bmscs移植結(jié)果30只模型大鼠中3只于STZ注射后死于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥;BMSCs移植共計27只,其中3只于BMSCs移植后死亡,原因與動物經(jīng)各種干預(yù)處理后體質(zhì)狀況下降,并發(fā)厭食、腹脹或感染所致,共24只納入結(jié)果。2.2brdu體外標(biāo)記bmscs的細胞原代培養(yǎng)第3天細胞集落生長匯合度可達50%~60%,細胞以梭形為主,排列較雜亂,見圖1a。傳代培養(yǎng)12h后細胞全部貼壁,48h后細胞基本為梭形,并呈漩渦狀排列,見圖1b。BrdU體外標(biāo)記的BMSCs陽性細胞其細胞核呈棕褐色,而未被標(biāo)記的細胞經(jīng)蘇木素復(fù)染后細胞核呈藍色,見圖2。隨機選取10個視野(×200),分別計數(shù)陽性細胞數(shù)和陰性細胞數(shù),根據(jù)陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比值計算的BrdU標(biāo)記率為(82±3)%。2.3大鼠bmscs的表型特征流式細胞儀表型鑒定的結(jié)果顯示,分離純化的大鼠BMSCs具有典型的間充質(zhì)干細胞表型特征,高表達CD90和CD29,不表達CD45,見圖3。2.4糖尿病制模檢測STZ注射前及注射1,7,14d的大鼠外周血血糖值分別為(5.4±0.5),(27.3±1.6),(27.3±2.2),(25.4±2.3)mmol/L,注射STZ后的血糖檢測值均高于16.7mmol/L的糖尿病制模標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病模型大鼠雙后肢結(jié)扎剝離股動脈及其分支后,后肢骨骼肌急性缺血并呈暗紫色,肢體冰冷。2.6移植細胞2周后雙術(shù)后血管觀察結(jié)果DSA結(jié)果顯示,未結(jié)扎股動脈的糖尿病大鼠雙后肢股動脈主干連續(xù),分支清晰,側(cè)支循環(huán)較少,見圖5a;糖尿病后肢缺血模型大鼠雙后肢股動脈主干于腹股溝韌帶處中斷,股動脈分支未見顯影;移植2周后雙后肢可見血管顯影,左側(cè)后肢較右側(cè)后肢血管稍豐富,見圖5b;移植6周后雙后肢血管更為豐富,左側(cè)高于右側(cè),見圖5c。蘇木精-伊紅染色組織切片毛細血管密度分析顯示,移植細胞2周后左側(cè)后肢股直肌毛細血管密度為0.296±0.10,高于右側(cè)后肢股直肌的密度(0.132±0.06,P<0.05);左側(cè)后肢腓腸肌的毛細血管密度為0.357±0.15,也高于右側(cè)后肢腓腸肌的密度(0.225±0.08,P<0.05)。3細胞移植對bmscs的分離與體外培養(yǎng)的意義糖尿病屬全身性疾病,常累及心腦血管、肝、腎、神經(jīng)等重要組織器官,并引發(fā)各種嚴重并發(fā)癥。在糖尿病基礎(chǔ)上并發(fā)下肢神經(jīng)和程度不同的血管病變致末梢供血不足,可以是二者之一或是兼而有之。在無有效控制干預(yù)措施下,糖尿病足可因難以治愈的下肢潰瘍、感染甚至壞疽,而最終只能通過截肢來挽救生命,成為非創(chuàng)傷性截肢的首要原因,也是臨床上必須面對的常見治療難題。近年來,以干細胞為代表再生醫(yī)學(xué)研究已成為糖尿病足治療研究新的關(guān)注點。骨髓干細胞是目前再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最常選用的種子細胞來源,這與其富含多種具有多潛能性的成體干細胞有關(guān)。Hamano等采用結(jié)扎左側(cè)股動脈及其分支的方式建立大鼠后肢局部缺血模型,用去除紅細胞后的骨髓細胞分7個點注射入缺血的肌肉中,移植骨髓細胞后可誘導(dǎo)左后肢血管新生,血流量增加。谷涌泉等分別采用小腿局部注射自體BMSCs移植,患者總的疼痛緩解改善率分別為76.5%,隨訪1年的保肢率為83.3%。這些研究提示,骨髓來源干細胞有望成為治療糖尿病足的種子細胞來源。深入研究移植細胞的存活、組織再生修復(fù)等體內(nèi)轉(zhuǎn)歸與機制,對評價骨髓源干細胞治療糖尿病足的應(yīng)用價值等具有重要意義。本實驗所用的BMSCs是存在于骨髓中的成體干細胞類型之一,盡管數(shù)目不低,但也僅占骨髓有核細胞的1/106~1/105。為滿足細胞移植所需的細胞數(shù)的要求,通常需要對其進行分離純化和體外擴增培養(yǎng),以滿足治療研究的實驗需求,這也是目前普遍開展干細胞體外培養(yǎng)擴增研究的意義所在。直接對分離的骨髓細胞采用貼壁培養(yǎng),以篩選純化BMSCs具有操作簡便,成本低,適合各種組織損傷性疾病BMSCs移植治療的研究。本實驗采用貼此法在原代培養(yǎng)48h換液去除未貼壁的血細胞,保留的貼壁細胞增值形成大小不等的細胞集落,培養(yǎng)約1周時可進行傳代培養(yǎng)。對傳代培養(yǎng)的細胞表型分析結(jié)果表明,其高表達CD29和CD90,不表達CD45,具備間充質(zhì)干細胞的表型特征,說明本實驗所分離、培養(yǎng)獲得的細胞為高純度的BMSCs。研究還表明,骨髓間充質(zhì)干細胞其數(shù)量和增值分化能力隨供者年齡增大而逐漸降低。鑒于此點考慮,本實驗選用二三周齡SD大鼠作為BMSCs來源,經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其集落形成能力旺盛,增值能力強,采自同一大鼠的BMSCs培養(yǎng)至第3代所獲用于移植的BMSCs總數(shù)在(4.0~5.0)×106個,可滿足2只模型大鼠左后肢的移植用量。移植BMSCs后的模型大鼠DSA血管造影顯示股動脈主干未見再通,但其周圍及其遠端出現(xiàn)豐富的“新”血管分布,并隨移植時間的推移越發(fā)明顯,移植BMSCs的左后肢血管多于右側(cè)后肢。由于DSA血管顯影技術(shù)不能就血管密度等進行定量分析,故僅憑DSA結(jié)果尚不能判定后肢血管這一特征性變化是干細胞移植后的血管新生還是自發(fā)再生抑或側(cè)支開放所致。值得關(guān)注的是,本實驗采用免疫組織化學(xué)染色觀察到模型大鼠移植2周后的BrdU標(biāo)記BMSCs參與了微動脈壁的構(gòu)成,且同一時間點組織切片左側(cè)股直肌和腓腸肌的毛細血管密度值均高于右側(cè)相應(yīng)部位,這一結(jié)果證實了移植的BMSCs參與了后肢缺血的血管重建。綜上所述,本實驗通過貼壁培養(yǎng)篩選法得到高純度、高活力的BMSCs。通過下肢肌肉多點注射移植糖尿病大鼠后肢缺血模型,初步證實了移植BMSCs參與了缺血組織血管重建的實驗證據(jù)。在深入闡明BMSCs移植治療糖尿病足的作用于機制前,還需對移植細胞數(shù)、移植部位與途徑等進行探索,同時,還需就移植BMSCs后缺血組織局部細胞因子表達變化等可能與移植細胞修復(fù)糖尿病足損傷有關(guān)的因素進行深入研究,以便為臨床采用BMSCs移植治療糖尿病足等下肢缺血性疾病的研究與應(yīng)用提供更為完整的理論依據(jù)。0糖尿病大鼠下肢率bmscs的移植治療自Tateishi-Yuyama等首次報道采用自體骨髓單個核細胞移植治療下肢缺血患者以來,骨髓來源干細胞移植治療缺血性疾病成為新的研究關(guān)注點。盡管骨髓源干細胞移植能改善糖尿病足下肢缺血性疾病的癥狀與體征,但目前仍不清楚是骨髓中哪類干細胞起主要作用,更缺乏移植細胞的體內(nèi)存活、分化及參與血管再生的實驗依據(jù)可循。骨髓含有造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞和間充質(zhì)干細胞等多種成體干細胞成分。研究表明,適宜條件下骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)具有分化為幾乎所有三胚層類型細胞的能力。已有研究證實BMSCs可向內(nèi)皮細胞分化,并可促進腫瘤血管形成。這些研究提示,BMSCs有望成為治療包括糖尿病足的在內(nèi)的下肢缺血性疾病種子細胞的新來源。故本實驗選擇具有多向分化能力的BMSCs,對糖尿病大鼠后肢缺血模型進行肌肉注射移植治療,通過BrdU標(biāo)記BMSCs體內(nèi)示蹤、數(shù)字減影血管造影結(jié)合毛細血管密度分析,以便對移植BMSCs的體內(nèi)存活、血管再生修復(fù)能力等進行科學(xué)評價,為今后BMSCs移植治療糖尿病足等缺血性疾病的研究和臨床應(yīng)用提供新的有價值的實驗依據(jù)。大鼠BMSCs表型分析及BrdU體外標(biāo)記:取第3代BMSCs,進行CD45、CD29和CD90表型分子的流式細胞儀檢測。同時,按1×107L-1細胞濃度接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,置37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)6h,避光加入終濃度為10μmol/L的BrdU繼續(xù)培養(yǎng)48h,取出蓋玻片,采用小鼠來源BrdU一抗結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗免疫細胞化學(xué)法,經(jīng)DAB顯色后隨機選取200倍鏡下10個視野,計算BrdU標(biāo)記細胞比率。大鼠糖尿病后肢缺血模型制備:雄性SD大鼠30只,經(jīng)普食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按55mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病模型。于注射后1,7,14d剪尾取血測血糖濃度,以血糖值>16.7mmol/L作為糖尿病制模成功標(biāo)準(zhǔn);糖尿病大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.35g