高效表達登革1型病毒ns1蛋白的多克隆抗體制備

高效表達登革1型病毒ns1蛋白的多克隆抗體制備

病毒登甲病毒是黃毒科黃毒科重要成員，可分為四種類型。感染人類后，可導(dǎo)致登甲熱、出血熱和登甲休克綜合征等疾病。登革病毒基因組為單股正鏈RNA,長約11kb,由單一的開放讀碼框(ORF)依次編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E)和七個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1為高度保守的糖蛋白,由352個氨基酸殘基構(gòu)成,分子量約為48kD。目前的研究表明,NS1蛋白參與病毒基因組的復(fù)制,可對干擾素、細(xì)胞因子通路及補體系統(tǒng)進行調(diào)控,在病毒感染、復(fù)制及病理過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)對登革1型病毒的NS1蛋白進行重組表達,獲得了具有免疫原性的重組蛋白,制備了相應(yīng)多克隆抗體,為進一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和克隆載體登革1型病毒GZ-57株和蚊C6/36細(xì)胞均由本室保存。大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京天根生化科技有限公司?？寺≥d體pGEM-Teasy購自Promega公司(美國)。原核表達載體pET-32a(+)為Merck公司產(chǎn)品(德國)。1.2膠純化試驗劑及酶細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640及胎牛血清為Gibco公司(美國)產(chǎn)品。RNA純化試劑盒、質(zhì)?？焖偌兓噭┖?、DNA凝膠純化試劑盒均為Qiagen公司(德國)產(chǎn)品。SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司(美國)產(chǎn)品。ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)均為大連寶生物公司產(chǎn)品。弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司(美國)產(chǎn)品。His標(biāo)簽抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。1.3dna引物的設(shè)計根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的登革1型病毒基因組全序列(GenBank登錄號;FJ176779.1)設(shè)計可擴增全長NS1基因的引物:5′-CGCGGATCCGATTCAGGATGCGTAATTAA-3′;5′-ATTTGCGGCCGCTGCAGAG-ACCATTGATTTGA-3′,并引入BamHⅠ和NotⅠ識別位點(下劃線),引物由上海英駿公司合成。1.4養(yǎng)基于28培養(yǎng)C6/36細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)。待長至單層后,接種登革病毒,吸附1h后換用含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),4d后細(xì)胞病變達到高峰時,收集培養(yǎng)上清用于提取RNA。1.5陽性克隆的構(gòu)建取RNA按如下條件進行反轉(zhuǎn)錄:65℃5min,冰浴1min,55℃1h,70℃15min。反應(yīng)完畢用RNaseH消化后,進行PCR擴增,具體反應(yīng)條件如下:94℃4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共35循環(huán);72℃延伸7min。膠純化回收特異的NS1擴增片段,與pGEM-Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR及酶切鑒定陽性克隆,目的片段經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后亞克隆至同樣雙酶切的pET-32a(+)載體,通過PCR及酶切篩選陽性克隆。并由上海英駿公司對陽性克隆進行測序分析。將鑒定正確的陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),獲得的工程菌株稱為BL21/pET-NS1。1.6目的蛋白溶液的制備擴大培養(yǎng)重組工程菌BL21/pET-NS1,使用0.1mmol/LIPTG于37℃誘導(dǎo)5h,收集菌體,用PBS緩沖液重懸菌體后進行超聲波破碎至菌液為半透明狀態(tài)。將超聲破碎后的菌液離心,分別收集上清和沉淀進行SDS鑒定。采用蛋白浸提法從SDS膠中回收純化目的蛋白。電泳結(jié)束后,將預(yù)染Marker和少許樣品條帶切下,進行染色和脫色。根據(jù)預(yù)染Marker和被染色樣品中目的條帶的位置,切下未被染色的目的蛋白帶,研碎后加入3～5倍體積的蛋白浸提液[0.05mol/LTris-Cl(pH7.9),0.1mmol/LEDTA,0.15mol/LNaCl,0.1%SDS],置4℃過夜,期間振搖3～4次。次日將浸提物于12000r/min離心10min,上清即為目的蛋白溶液。將目的蛋白溶液置于2%NaHCO3煮沸激活后的透析袋中,置復(fù)性液[0.05mol/LTris-Cl(pH7.9),0.1mmol/LEDTA,0.2mol/LNaCl,0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽,1mmol/L還原型谷胱甘肽]中4℃過夜,期間換復(fù)性液2～3次。1.7家兔的tbt-his標(biāo)簽抗體tj表達產(chǎn)物經(jīng)SDS電泳分離,半干轉(zhuǎn)移儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用含5%脫脂奶粉的TBST4℃封閉過夜。以本室制備的兔抗登革病毒血清(1∶200)或His標(biāo)簽抗體(1∶2000)作為一抗,堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠及羊抗兔IgG(1∶1000)作為二抗進行孵育。最后用BCIP/NBT顯色。1.8動物中心6周齡雌性BALB/c小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。將純化復(fù)性的重組NS1蛋白透析至PBS中免疫小鼠,劑量為50μg/只,頸背部皮下多點注射,共免疫4次,間隔時間為2周。1.9間接免疫熒光檢測第4次免疫后10d,斷尾采血,5000rpm離心收集血清,56℃滅活后梯度稀釋與制備的登革病毒抗原片進行間接免疫熒光檢測,具體步驟參見文獻。待熒光效價超過1∶1000,處死小鼠并取血,分離血清備用。2基因重組表達質(zhì)粒及免疫小鼠血清n1的表達以提取的登革病毒RNA為模板,通過RT-PCR方法擴增全長NS1基因,用BamHI/NotI雙酶切獲得NS1基因片段后定向插入pET-32a(+)載體中,重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定均與預(yù)期結(jié)果吻合(圖1)。經(jīng)測序證明序列與NS1基因序列一致,表明獲得了NS1基因重組表達質(zhì)粒pET-NS1。陽性克隆菌在0.1mmol/LIPTG37℃誘導(dǎo)5h后表達達到高峰。蛋白(含融合標(biāo)簽Trx)經(jīng)SDS電泳測定相對分子量約為55kD,與預(yù)測分子量大小一致。超聲裂解后進行SDS,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要以包涵體形式存在,使用BandScan軟件分析重組蛋白占菌體總蛋白的50%以上。采用蛋白浸提法回收純化后重組蛋白,SDS顯示重組NS1蛋白的純度在95%以上。Westernblotting檢測結(jié)果顯示免疫血清及標(biāo)簽抗體均可與重組蛋白反應(yīng),并于55kD處顯出陽性條帶(含融合標(biāo)簽Trx)。NS1蛋白免疫小鼠血清與登革1型病毒感染的C6/36細(xì)胞抗原片進行間接免疫熒光試驗,結(jié)果顯示所獲得的NS1抗血清對病毒感染細(xì)胞起陽性反應(yīng),胞質(zhì)內(nèi)可見特異綠色熒光,效價可達1∶1000以上(圖2)。結(jié)果成功制備了抗登革1型病毒NS1蛋白的多克隆抗體。3重組蛋白的誘導(dǎo)表達本研究中,筆者使用含硫氧化還原蛋白Trx融合標(biāo)簽的原核表達載體系統(tǒng),對登革病毒NS1蛋白進行重組表達。結(jié)果表明重組NS1蛋白主要以包涵體的形式存在。降低誘導(dǎo)溫度、改變IPTG濃度等方法也未對可溶性蛋白的產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響。分析登革病毒NS1蛋白序列發(fā)現(xiàn),其包含12個保守的半胱氨酸殘基,這些殘基間二硫鍵的形成方式可能會對重組蛋白的表達形式產(chǎn)生影響。同時NS1蛋白還存在2個N-糖基化位點,而原核表達系統(tǒng)無法對重組蛋白進行翻譯后的糖基化修飾,從而使重組表達的NS1與天然NS1蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異,這可能也是前者形成包涵體的原因之一。最近,Das等對NS1蛋白進行密碼子優(yōu)化的重組表達,結(jié)果在大腸埃希菌中表達的重組NS1蛋白仍以包涵體的形式存在。登革病毒NS1蛋白具有良好的免疫原性,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異的抗體反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),NS1抗體不僅能夠?qū)Φ歉锊《靖腥镜男∈笥斜Ｗo作用,而且能夠與血小板表面的蛋白二硫鍵異構(gòu)酶結(jié)合,在