抗體-型登革熱病毒結(jié)合k562細(xì)胞的抗體依賴增強(qiáng)作用

抗體-型登革熱病毒結(jié)合k562細(xì)胞的抗體依賴增強(qiáng)作用

病毒登格熱（denv）是黃毒科黃色病毒的一個屬，通過埃及蚊和白紋蚊傳播。目前世界上100多個國家有登革熱流行,約25億～30億人受其威脅,每年新增約1億感染病例及24000人死亡。在臨床上可引起登革熱、登革出血熱和登革休克綜合征。登革熱有4種血清型,分別為DENVⅠ、DENVⅡ、DENVⅢ、DENVⅣ,初次感染其中一種型別的登革熱病毒后,機(jī)體會產(chǎn)生針對此型病毒的特異性抗體。如再次感染該型病毒,病毒抗原與抗體形成免疫復(fù)合物,與單核-吞噬細(xì)胞表面的Fc受體或補(bǔ)體結(jié)合,在這些細(xì)胞中大量復(fù)制并且毒力增強(qiáng),出現(xiàn)抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(ADE),導(dǎo)致血管通透性增加、血漿外滲、血容量減少,血液濃縮和休克等一系列病理變化[7,8,9,10,11,12,13]。由于初次感染產(chǎn)生的型特異性抗體不僅對其他型別的登革熱病毒沒有交叉免疫保護(hù)作用,甚至在異型病毒二次感染時還可能增強(qiáng)病毒的感染,導(dǎo)致更為嚴(yán)重的DHF/DSS,給登革熱病毒的疫苗研究帶來了很大的挑戰(zhàn)和困難。因此有關(guān)登革熱ADE作用的探討對于登革熱的治療、預(yù)防及疫苗的相關(guān)研究具有重要意義。登革出血熱和登革休克綜合征(DHF/DSS)的發(fā)病機(jī)制一直是國內(nèi)外研究的重點,但至今尚未完全闡明,絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,抗體依賴的感染增強(qiáng)作用是DHF/DSS重要的發(fā)病機(jī)制。本研究通過抗Ⅱ型登革熱prM單克隆抗體,與Ⅲ型登革熱病毒共同孵育后形成抗體-病毒復(fù)合物,然后感染K562細(xì)胞(細(xì)胞表面僅存在FcγRⅡ),進(jìn)行登革熱感染的抗體依賴增強(qiáng)作用的體外模擬實驗,獲得了預(yù)期的效果,為體外研究登革熱抗體依賴性感染增強(qiáng)作用及登革熱病毒感染引起的登革出血熱和登革休克綜合征的作用機(jī)制提供可靠的模型和實驗基礎(chǔ)。材料和方法1.病毒DENVIIID9964,由廣東省疾病預(yù)防控制中心惠贈。2.細(xì)胞C6/36細(xì)胞(本實驗室保存),人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562(云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所惠贈)。3.型登革熱人源抗血清Eagle′sMEM培養(yǎng)液,PRMI1640培養(yǎng)液(均購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司),Ⅲ型登革熱人源抗血清(英國國家生物制品檢定所NIBSCcode:02/274);FITC標(biāo)記的羊抗人IgG[生工生物工程(上海)有限公司],抗登革熱prM單克隆抗體(mousemonolclonaltodenguevirusPrmglycopropein.(ab41473),Abcam公司)。4.細(xì)胞病變傳代將C6/36按常規(guī)傳代培養(yǎng),在其長成單層后接種登革熱病毒DENVⅢ,接種7天后,細(xì)胞病變約90%時收獲病毒懸液連續(xù)進(jìn)行傳代,并通過免疫熒光染色和RT-PCR鑒定。將收獲的第9代病毒懸液于-20℃凍融2次,4000r/min4℃,離心10min,取上清,然后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.感染細(xì)胞2.7天的判定50的測定:用MEM維持液將DENVⅢ做10倍系列稀釋,每個稀釋度設(shè)8個復(fù)孔,每孔加入C6/36(細(xì)胞數(shù)約為1.5×104)和DENVⅢ各80μl,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天,以使感染細(xì)胞在第7天病變達(dá)50%以上的稀釋度作為判定結(jié)果。6.間接免疫熒光檢測細(xì)胞增殖將DENVⅢ,以MOI=1、3、5分別感染K562細(xì)胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),感染后72h選取細(xì)胞懸液通過間接免疫熒光染色觀察病毒增殖情況。7.抗體-病毒混合物感染k562細(xì)胞將Ⅱ型DENV抗-prM單克隆抗體用1640維持液以1/40960～1/160系列稀釋,分別與DENVⅢ(MOI=3)結(jié)合,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90min后將形成的抗體-病毒復(fù)合物感染K562細(xì)胞,37℃、5%CO2孵育2h后補(bǔ)充1640維持液繼續(xù)培養(yǎng)72h。8.人源血清intenvivi酸,pbs分別將細(xì)胞懸液從6孔板轉(zhuǎn)到離心管中,800r/min離心5min,棄上清,加入固定液,每管500μl,于4℃固定30min。用PBS洗3次,每次3min。最后1次洗滌留取約60μlPBS,將細(xì)胞懸起,滴到已置入6孔板中的蓋玻片上。稍晾干后加封閉液每孔2ml,37℃封閉30min。PBS洗2次,每次5min,隨后加入1∶200稀釋的一抗(Ⅲ型登革熱人源抗血清),4℃過夜。PBS洗2次,每次5min。加入1∶250稀釋的二抗(FITC標(biāo)記的羊抗人IgG)37℃避光1h。PBS洗2次,每次5min(避光)。甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并照相。9.毒通用引物按照AXYGEN公司的AXY/Prep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒說明提取RNA。采用登革熱病毒通用引物(中華人民共和國行業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)WS216-2008):D1:5′-TCAATATGCTGAAACGCGGCGAAACCG-3′,D2:5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′使其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,溫度設(shè)置為50℃30min,95℃2min,于-20℃保存。10.實時熒光定量pcr反應(yīng)根據(jù)參考文獻(xiàn)采用登革熱病毒通用引物,DENV-FP:5′-TAGAGAGCAGATCTCTGATGAA-3′,DENV-RP:5′-TGAGAATCTCTTCGCCAAC-3′,以反轉(zhuǎn)錄所形成的cDNA為模板,根據(jù)OneStepSYBR?PrimeScript?RT-PCRKitⅡ(perfectreal-time)試劑盒說明書建立PCR反應(yīng)體系,25μl的反應(yīng)體系為:12.5μl2×OneStepSYBR?RT-PCRBuffer,1μlPrimeScript1StepEnzymeMix,6.5μl無RNA酶去離子水(RNaseFreedH2O),上下游引物各1μl,cDNA模板3μl。反應(yīng)條件為:95℃15s,50℃15s,72℃15s,共40個循環(huán)。每個稀釋度的樣品分別設(shè)3個復(fù)孔。熒光定量儀器型號為CFX96TMreal-timeSystem(Bio-Rad)。結(jié)果1.ctid50病毒效率計算根據(jù)96孔板細(xì)胞病變結(jié)果,按照Karber法計算出感染性效價TCID50值為:10-7.75。2.細(xì)胞免疫熒光DENVIII以MOI=1、3、5分別感染K562細(xì)胞72h后,固定細(xì)胞并進(jìn)行免疫熒光染色,結(jié)果顯示以MOI=3的病毒感染的細(xì)胞有相對較強(qiáng)免疫熒光染色,而以MOI=1、5的病毒數(shù)感染的細(xì)胞染色結(jié)果較弱(圖1)。3.抗體免疫熒光染色結(jié)果與未加抗體的實驗組相比,被亞中和效價的抗體-DENVⅢ病毒復(fù)合物(抗體稀釋度1/2560)感染后的K562細(xì)胞,登革熱抗原免疫熒光染色結(jié)果最強(qiáng),其他稀釋度的抗體與病毒孵育形成的抗體病毒復(fù)合物感染K562細(xì)胞后,登革熱抗原免疫熒光染色的結(jié)果較弱或未被染色(圖2)。4.實時熒光定量pcr反應(yīng)登革熱病毒-抗體復(fù)合物感染K562細(xì)胞,72h后收獲細(xì)胞,提取病毒RNA,根據(jù)OneStepSYBR?PrimeScript?RT-PCRKitⅡ(PerfectRealTime)試劑盒說明書,進(jìn)行real-timePCR反應(yīng)?？贵w稀釋度為1/2560的登革熱病毒-抗體復(fù)合物感染的K562細(xì)胞樣本反應(yīng)管的Ct平均值最小,即其所對應(yīng)的模板起始拷貝數(shù)最高(圖3、圖4)。denv在k562細(xì)胞上的增殖成熟的登革病毒顆粒呈球形,其核衣殼含單股正鏈RNA,大小約為11kb,含有1個開放閱讀框(ORF),編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白C、膜結(jié)合蛋白M和包膜蛋白E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。prM蛋白是一種糖蛋白,為M蛋白的前體,在病毒成熟過程中prM糖蛋白經(jīng)特異性酶切后形成M蛋白,它能導(dǎo)致病毒感染增強(qiáng),并形成毒粒的表面結(jié)構(gòu)?？沟歉餆醦rM單克隆抗體可以識別DENV的膜前蛋白和自身抗原如HSP60,并利用這種雙特性使病毒結(jié)合到FCR+或FCR-的細(xì)胞上并在細(xì)胞內(nèi)大量增殖。本實驗采用FCR+的K562細(xì)胞(細(xì)胞表面僅存在FcγRⅡ)來模擬體外登革熱病毒ADE。實驗研究發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)性抗登革熱prM抗體可以提高DENV對K562細(xì)胞的感染率,且抗體依賴增強(qiáng)作用的強(qiáng)度取決于抗體濃度及登革熱血清型。本實驗通過免疫熒光染色和real-timePCR檢測DENV在細(xì)胞內(nèi)的增殖。分別用MOI=1、3、5的DENV感染K562細(xì)胞,染色結(jié)果顯示MOI=3的病毒感染效果最好,正常細(xì)胞有少量呈非特異性染色,但不影響結(jié)果觀察。而系列稀釋的抗體與MOI=3病毒結(jié)合感染細(xì)胞后的染色結(jié)果顯示,抗體稀釋度為1/2560時的感染率有顯著增強(qiáng),并通過real-timePCR的Ct平均值進(jìn)一步證實了病毒感染率的增強(qiáng)。因real-timePCR實驗過程中采用的樣本為病毒感染細(xì)胞懸液后提取的核酸,故不需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線及內(nèi)參,只需通過Ct值相對定量模板量。起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。本實驗中抗體稀釋度為1/2560時的Ct平均值最小,即此稀釋度的抗體-DVⅢ復(fù)合物感染K562后的病毒模板起始拷貝數(shù)最多,病毒感染率最強(qiáng)。在免疫熒光染色過程中,稀釋度為1/10、1/40、1/160、1/163840的抗體與病毒結(jié)合感染細(xì)胞后,鏡下染色結(jié)果顯示這些稀