還原糖法-葡聚糖酶活測(cè)值的研究

還原糖法-葡聚糖酶活測(cè)值的研究

-這是植物壁的主要成分之一。由于其本身很難被消化，一些養(yǎng)分的消化和利用對(duì)動(dòng)物和食物中的各種養(yǎng)分的消化和利用起到了明顯的干擾和抑制作用。研究表明,添加含有β-葡聚糖酶的飼用復(fù)合酶制劑不僅能有效地消除β-葡聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用,而且能促進(jìn)飼料中各種養(yǎng)分的消化和吸收利用,提高飼料代謝能值(Walsh等,1993)和動(dòng)物的生產(chǎn)性能,增進(jìn)畜禽健康,減少畜禽排泄物對(duì)環(huán)境的污染及拓寬飼料原料的范圍(Inborr,1993)。但飼用復(fù)合酶制劑中β-葡聚糖酶活的測(cè)定迄今尚無統(tǒng)一的方法,使同類產(chǎn)品的酶活測(cè)值失去可比性,因此研究和建立合理的統(tǒng)一的β-葡聚糖酶活測(cè)定方法很有必要。本試驗(yàn)選擇幾種國(guó)內(nèi)外具有代表性的飼用復(fù)合酶制劑作為研究對(duì)象,以目前廣泛應(yīng)用的還原糖法(Miller,1959)為基礎(chǔ),研究不同酶促反應(yīng)時(shí)間、溫度和pH值對(duì)β-葡聚糖酶活測(cè)值的影響,并提出合理的β-葡聚糖酶活測(cè)定方法。1材料和方法1.1自動(dòng)分析和光柵分光光度計(jì)算方法1.1.1精密pH計(jì),±0.01pH;1.1.2自動(dòng)分析電子天平,d=0.1mg;1.1.3光柵分光光度計(jì),722型;1.1.4恒溫水浴鍋。1.2試劑和溶液1.2.1磷酸氫二鈉溶液和檸檬酸溶液配制稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)71.628g和檸檬酸(C6H8O7·H2O)21.014g,用加熱沸騰后冷卻至室溫的蒸餾水,定容至1000mL,分別配成0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和0.1mol/L的檸檬酸溶液。再以不同比例的磷酸氫二鈉溶液和檸檬酸溶液混合(李建武等,1994),配制成pH2.6、3.6、4.5、5.3、5.85、6.35和7.35的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液。1.2.2an底物溶液準(zhǔn)確稱取1.0000g大麥β-葡聚糖(Barleyβ-glucan,美國(guó)Sigma公司),溶于6mL無水乙醇中,加入80mL緩沖液,置于100℃水浴中,攪拌10min左右,溶解后,冷卻至室溫,用緩沖液定容至100mL,底物溶液在4℃下最多保存一周。1.2.3l/堿法制備酒石酸鉀鈉法溶解10.0g2-羥基-3,5-二硝基水楊酸(DNS)于800mL水中,不斷攪拌,緩緩加入16.0g氫氧化鈉,使之完全溶解,再繼續(xù)攪拌,分?jǐn)?shù)次少量加入300.0g酒石酸鉀鈉,并小心加熱,溶液最高溫度不超過45℃。冷卻至室溫后定容至1000mL,室溫保存于棕色瓶中備用。1.3飼料中的復(fù)合酶制劑飼用復(fù)合酶制劑分別為國(guó)內(nèi)外4個(gè)酶制劑公司產(chǎn)品,分別記作1#、2#、3#、4#。1.4沉淀率的提取精密稱取約1.0000g酶制劑樣品于50mL燒杯中,加入約40mL緩沖液,磁力攪拌提取15min,靜置沉淀后用中速定量濾紙過濾到100mL容量瓶中;再加入20～30mL緩沖液,磁力攪拌提取5min,靜置沉淀后過濾;第3次加入約10mL緩沖液,磁力攪拌提取5min后連同殘?jiān)黄鸬谷霝V紙中,用緩沖液充分沖洗殘?jiān)蠖ㄈ葜?00mL(此時(shí)稀釋倍數(shù)定為100,通過調(diào)整樣品稀釋倍數(shù)使吸光度在0.1～0.4之間)。1.5酶活的反應(yīng)取2支25mL具塞試管,分別加入1.8mLβ-葡聚糖底物,置40℃水浴中保溫5min。在其中一支試管中加入200μL稀釋酶樣,磁力旋轉(zhuǎn)攪拌均勻,置于40℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)20min,加入2.0mLDNS試劑至兩支試管中,攪拌均勻。在另一支試管(空白管)中加入200μL稀釋酶樣,同時(shí)將兩支試管放入100℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min,取出置入冷水中冷卻至室溫。兩支試管各加入20mL蒸餾水,混合均勻,在540nm處測(cè)量酶樣對(duì)空白的吸光度。1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定將1.405g葡萄糖溶解于緩沖液中,并用緩沖液定容至100mL,得0.078mol/L葡萄糖(D-glucose)儲(chǔ)備液(葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。儲(chǔ)備液可分成少量在低溫冰箱冰凍,使用前,融解并混合均勻。用緩沖液稀釋儲(chǔ)備液按表1配制以下標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。每種標(biāo)準(zhǔn)稀釋液做2次重復(fù)測(cè)定。取4支25mL具塞試管,分別為空白管和標(biāo)準(zhǔn)1、2、3管。在4支試管中分別加入1.8mLβ-葡聚糖底物溶液,40℃水浴保溫5min。先在空白管中加入0.2mL緩沖液,由水浴中取出標(biāo)準(zhǔn)1～3管,準(zhǔn)確加入0.2mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)稀釋液(39μmol/mL、26μmol/mL、13μmol/mL)時(shí)計(jì)時(shí),在微型振蕩器上振蕩使之混合均勻,放回水浴中繼續(xù)保溫。到20min時(shí),向各管加入2.0mLDNS,振蕩使之混合均勻。將4支試管轉(zhuǎn)入100℃水浴中保溫5min,冷卻后在540nm處測(cè)量樣品對(duì)空白的吸光度。每批樣品制備1次標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=a+bx式中Y:吸光度;X:葡萄糖濃度(μmol/mL);a:截距;b:斜率。1.7bu/g酶活(BU/g)=稀釋倍數(shù)×1000×(吸光度?a)反應(yīng)時(shí)間(s)×樣品重(g)×b酶活(BU/g)=稀釋倍數(shù)×1000×(吸光度-a)反應(yīng)時(shí)間(s)×樣品重(g)×b1BUβ-葡聚糖酶活單位定義為:在測(cè)定條件下,1s中從大麥β-葡聚糖中產(chǎn)生1nmol葡萄糖所需的酶量。1.8ph值的測(cè)定按照1.5測(cè)定方法改變反應(yīng)時(shí)間、溫度或底物緩沖液pH值,測(cè)定樣品的吸光度。以酶樣最大吸光度的相對(duì)酶活為100,其他條件下的吸光度為最大吸光度的百分?jǐn)?shù)即為該酶在其它條件下的相對(duì)酶活。2結(jié)果與討論2.1色原法與ds法目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及各酶制劑公司提供的用于測(cè)定飼用復(fù)合酶制劑中β-葡聚糖酶活的方法有還原糖法、粘度法、色原底物法和放射瓊脂擴(kuò)散法等。Buckee(1985)等人認(rèn)為粘度法的主要缺點(diǎn)是重復(fù)性差、費(fèi)時(shí)、操作復(fù)雜、單位難以換算成酶活單位;Barbara(1990)認(rèn)為色原法重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便,靈敏度較高,但利用人工合成底物來檢測(cè)酶活,酶作用于合成底物與作用于天然底物有差別,對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性可能有影響;Bruce等(1993)和Carder(1986)指出,以剛果紅為展開劑的瓊脂擴(kuò)散法的靈敏度很高,但該法由于受底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、瓊脂盤的pH值以及染色方式等諸多因素的影響,尚未被廣泛應(yīng)用。Miller(1959)采用的3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法(DNS法)目前已廣泛應(yīng)用于β-葡聚糖酶活的測(cè)定中。其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)顏色穩(wěn)定性好,操作簡(jiǎn)單,可用標(biāo)準(zhǔn)還原糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。故我們用還原糖法測(cè)定β-葡聚糖酶活,并研究了使大多數(shù)酶制劑產(chǎn)品獲得最高β-葡聚糖酶活的酶促反應(yīng)條件。2.2反應(yīng)時(shí)間對(duì)-葡聚糖酶活的影響在底物緩沖液pH值為5.85、水浴溫度40℃的條件下,研究不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)β-葡聚糖酶活的影響。結(jié)果見表2。由表2可看出,在pH5.85、40℃的條件下,大多數(shù)酶樣反應(yīng)20min時(shí)酶活測(cè)值最大。2.3聚糖酶活的影響在底物緩沖液pH值為5.85、反應(yīng)10min的條件下,研究不同反應(yīng)溫度對(duì)β-葡聚糖酶活的影響。結(jié)果見表3。從表3可看出,在pH5.85、反應(yīng)10min的條件下,1#、2#酶樣β-葡聚糖酶活測(cè)值最大的反應(yīng)溫度均為60℃,3#酶樣β-葡聚糖酶活測(cè)值最大的反應(yīng)溫度為50℃,4#酶樣β-葡聚糖酶活測(cè)值最大的反應(yīng)溫度為70℃。2.4同底物ph值對(duì)酶活的影響在反應(yīng)溫度為40℃、時(shí)間為20min的條件下,研究不同底物pH值對(duì)β-葡聚糖酶活的影響。結(jié)果見表4。由表4可見,在40℃、反應(yīng)20min的條件下,各酶樣反應(yīng)pH為6.35時(shí)酶活測(cè)值最大,pH5.85時(shí)酶活測(cè)值也較高。2.5豬腸道及克氏原螯蝦對(duì)酶的主要作用由表2～4可看出,用還原糖法測(cè)定β-葡聚糖酶活時(shí),大多數(shù)復(fù)合酶制劑中β-葡聚糖酶活最大的酶促反應(yīng)條件是20min、60℃和pH6.35。但上述反應(yīng)條件只是酶活體外測(cè)定的最適條件,而飼用酶真正的作用環(huán)境是體內(nèi)。畜禽體內(nèi)環(huán)境與體外測(cè)定最適條件有一定的差距,如畜禽體溫為40℃左右,不可能達(dá)到60℃。為了能準(zhǔn)確地反映酶在畜禽體內(nèi)的活力狀態(tài),Hedden和Grahan(1995)建議飼用酶體外測(cè)定條件盡可能接近酶在畜禽體內(nèi)的作用環(huán)境。盡管目前對(duì)酶在畜禽消化道哪一段起主要作用還不很清楚,但一般認(rèn)為,十二指腸、空腸是畜禽消化吸收的主要腸段(鄭祥建、韓正康,1997)。Farner(1942)指出雞十二指腸—空腸段的pH值為5.8～6.0,Makkink等(1994)指出豬十二指腸—空腸